实验技术 | 深入解析：各类PCR技术及其详细应用指南

非诚勿扰孟非

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）作为分子生物学的基石技术，不同类型的PCR方法在实验中扮演着各自独特的角色。本文将深入探讨各类PCR技术的原理、应用及其细分类型，帮助您在科研与诊断中做出最佳选择。

传统PCR

别称：标准PCR、经典PCR
原理：传统PCR利用DNA聚合酶在特异性引物的指导下，通过反复的热循环对目标DNA片段进行指数级扩增。





应用：用于基因克隆、基因突变检测、遗传多态性分析以及病原体检测。
      PCR是各种类型PCR技术的基础，它提供了扩增DNA片段的核心机制。RT-PCR、qPCR、RT-qPCR、多重PCR、巢式PCR、dPCR等都是在此基础上发展出来的衍生技术。每种技术都针对特定的应用场景进行了优化，因此，需要根据实验需求选择合适的PCR技术。

1

qPCR（Quantitative PCR，实时PCR）

别称：实时定量PCR、Real-Time PCR
原理：利用荧光染料或探针实时检测PCR扩增过程中产生的DNA，以实现定量分析。
应用：广泛应用于基因表达定量、拷贝数变异分析、微生物定量检测等。

SYBR Green

原理：SYBR Green是一种能够嵌入到双链DNA中的荧光染料，随着PCR反应中DNA的积累，荧光信号逐渐增强。





优点：操作简单，成本较低，适用于广泛的应用。
缺点：特异性扩增也会产生荧光信号，需要严格的后续熔解曲线分析来区分特异性和非特异性产物。

探针法Probe-based qPCR

原理：探针法使用标记有荧光基团和猝灭基团的特异性探针，在PCR扩增过程中，当探针被DNA聚合酶切割时，荧光信号被释放。





优点：特异性更高，能够区分非常接近的序列变异，如SNP检测。
缺点：探针设计复杂，成本较高。

选择指南：

• 如果需要进行精确的基因定量并且目标序列已知，探针法是最佳选择。
  
• 如果是初步定量分析且预算有限，SYBR Green法是不错的选择。
  

2

RT-PCR（Reverse Transcription-PCR，逆转录PCR）

别称：两步法RT-PCR
原理：RT-PCR中，逆转录和PCR扩增步骤分开进行。首先，在逆转录步骤中，将RNA逆转录为cDNA；然后，在单独的PCR反应中使用cDNA作为模板进行扩增。





优点：

• 灵活性高：可以分别优化逆转录和PCR反应条件，从而提高cDNA合成和扩增的效率；
  
• 可储存cDNA：逆转录后的cDNA可以储存起来，供以后进一步分析使用；
  
• 适用性广：适合复杂样本、低丰度RNA的检测，以及需要高灵敏度和特异性的实验。
  

缺点：

• 步骤繁琐：需要更多的操作步骤和反应管，增加了时间和污染风险；
  
• 时间消耗大：整个过程需要更多时间，适合需要精确结果而不急于时间的实验。
  

应用：常用于基因表达研究、高灵敏度的RNA分析、实验优化等需要精确结果的研究。

RT-qPCR
（Reverse Transcription Quantitative PCR, 逆转录实时定量PCR）

别称：一步法RT-PCR、实时定量RT-PCR
原理：RT-qPCR结合了RT-PCR和qPCR技术，将RNA转录为cDNA，然后进行扩增。





优点：操作简便、时间节省，适合快速检测。
缺点：灵活性较低，无法优化逆转录和PCR两个步骤的反应条件，可能导致cDNA合成效率或PCR扩增效率下降。
应用：通常用于快速定量检测、诊断测试等需要快速结果的实验。

3

多重PCR（Multiplex PCR）

原理：多重PCR在一个反应体系中使用多个引物对，能够同时扩增多个不同的DNA片段。
应用：用于多病原体检测、遗传多态性分析、多基因型检测等。
选择指南：如果实验需要同时检测多个目标基因或突变，且时间和成本有限，多重PCR是最佳选择。





4

嵌套PCR/巢式PCR（Nested PCR）

原理：嵌套PCR通过两轮PCR扩增，使用不同的一对引物来提高目标扩增的特异性。
应用：常用于复杂样本中低拷贝数目标的检测，如微量DNA分析。
选择指南：当背景噪声较大或目标序列极其低丰度时，嵌套PCR可显著提高检测特异性和灵敏度。





5

数字PCR（Digital PCR，dPCR）

原理：将样品分成成千上万的小反应单元，每个单元单独进行PCR反应，最终通过统计阳性反应单元的数量来进行绝对定量。
应用：适用于检测低丰度的基因突变、拷贝数变异、精准分子计数，如癌症中的稀有突变分析。
选择指南：当需要超高灵敏度和精确性的定量检测，特别是处理低丰度样本时，dPCR是无可替代的选择。




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