液态活检的应用有哪些？

青草

题记：液态活检由于全面、无创、实时等优点而推崇备至，既然它有这些独到的优点，那么它在肿瘤领域有何实际应用呢？本篇文章总结探索这个问题。
液态活检可以应用到人一生中的什么时机呢？婴幼儿、儿童、少年、青壮年、老年？
这个问题可以从以下几个方面回答：1，有一次听核子基因公司CEO讲座，他们主要的宣传点便是基因检测伴随你的一生，从小时候的天赋基因检测到老年时期疾病的检测；健康人的基因检测一般都是用唾液，因此可以说液态活检同样是伴随人的一生。胎儿时期：无创产前诊断，筛查疾病；儿童少年时期：天赋基因检测（艺术、运动、智力等，这方面虽然不成熟但是是有一定科学依据的）；青壮年：疾病早筛；老年：疾病早筛、用药指导、动态监测等；2，聚焦至肿瘤领域，这包括：早期检测、靶向治疗、预后监测、耐药分析。早期检测可以大大提高癌症的治愈率，例如结直肠癌早期5年生存率可达90%，而晚期却只有13%，因此早筛本身具有重要意义；这就是经常听到的“早发现，早诊断，早治疗”。肿瘤是一种基因病，基于液态活检可以明确癌症患者驱动基因突变状态从而指导用药（靶向治疗），除此之外，化疗药的毒副作用与个体基因状态也有一定的相关性（这部分还未得到临床医生的广泛认可，实际应用比较少，还有待研究），指导用药是液态活检应用的较多的一部分。

液态活检的应用情况怎么样？
这个问题从几个方面讲：1，总的来说临床医生及相关专家目前达成共识，组织活检仍然是金标准，液态活检处于追赶补充地位。因此，近来有学多文章是关于组织与血液检测一致性问题的研究，并且一致性方面取得了较好的结果。2，在回答这个问题之前有必要先明确一些事实。通过对几个主要癌种的 研究发现：晚期肿瘤中ctDNA检出率明显高于早期肿瘤，这个非常容易理解，晚期肿瘤是发生远处转移的，而远处转移的主要渠道就是淋巴结与血液，在血液中检测到ctDNA的概率肯定会更大，而早期肿瘤未发生转移且脱落至血液的DNA片段较少，因此早期检测到ctDNA的几率较小；每个癌种早晚期ctDNA检出率有所差异，例如结直肠癌（晚期 > 75%  PK 早期 73%），乳腺癌（晚期 > 75% PK 早期50%），因此对于具体癌种应该需要具体分析；即使是晚期，大多数癌种也不能保证100%检测到ctDNA，只能说有些癌种检测到ctDNA概率大，有些癌种检测到ctDNA概率低；每个癌种的检测到的突变片段的数目有所不同，例如晚期结直肠癌的ctDNA平均浓度（10000个/5ml）就显著高于神经胶质瘤（~7个/5ml）和膀胱癌，这可以看出征对有些癌种必须使用灵敏度较高的方法进行检测。3，大家都知道癌症需要“早发现、早诊断、早治疗”，如果没有任何症状就想确认现在是否患癌症怎么办？如果经其他检测（如影像学检测）发现某处有结节，想确认是否为恶性肿瘤怎么办？这属于癌症早筛的范畴。咨询公司负责癌症早筛的同事了解到：目前通过液体活检癌症早筛还不太成熟；主要由于以下原因，早期肿瘤患者的ctDNA检出率比较低，健康人cfDNA本来就有许多突变（基因多态性），从而不容易判断某种特定的突变是否是真正的肿瘤发生的突变（目前没有大样本数据库可作为参考，需要各公司积累样本和数据），即使是公司出具报告也不作为诊断报告，比较保险的做法是：影像学已证实为癌症高危患者，ctDNA检测到该部位肿瘤的热点突变，血液肿瘤标记物提示该癌肿高危，已有的健康人中无该突变 。即使这样的情况，也不能作为诊断依据。此外，根据（GarrigouS, et al. Clin Chem 2016, 62）来看，ctDNA还不能作为结直肠癌的筛查工具。然而，这里有一种广为接受的被CFDA批准的Septin9基因甲基化检测试剂盒，它可应用于临床的无创早期大肠癌检测，受检者只需抽取一小管血液即可。根据Epigenomics Septin9 (proColon)和博尔诚 Septin9 (SensiColon)的数据，各分期总体结直肠癌的检出率为73.0%-76.6%，其中0期或者I期的检出率为50%左右，IV期可达90%以上；值得一提的是：Septin9检测结果仅对大肠癌做辅助诊断，检测结果阳性不作为大肠癌确诊的证据，检测结果阴性也不能排除大肠癌的可能；根据2016年一篇meta-analysis对485篇文章分析得出，灵敏度为0.62，特异性为0.91。3，指导用药是液态活检发展的较为成熟的一块。除了外科手术、放射治疗、化学疗法，靶向治疗是肿瘤治疗的重要组成部分。靶向治疗对基因检测的依赖性相对比较高，简单地讲我们需要明确患者哪个基因/分子有问题才能给出相应的靶向药物，而有些基因出问题了某些靶向药物是不能够使用的，因为使用后除了增加毒副作用和经济负担并没有任何好处。在谈论这个问题之前还是要重新申明一下：组织检测仍然是金标准。2014年欧盟EMA批准易瑞沙标签更新，使医生可使用血液ctDNA伴随诊断对NSCLC EGFR突变情况进行评估，2015年2月，CFDA批准了易瑞沙中文说明书改动：“如果肿瘤标本不可评估，则可使用从血液（血浆）标本中 获得的循环肿瘤DNA（ctDNA）”，2016年6月，美国FDA批准特罗凯的伴随诊断试剂盒 coba EGFR Mutation Test v2用于使用血液ctDNA评估NSCLC EGFR的突变情况。在第十三届中国肺癌高峰论坛上，吴一龙教授总结的共识三中提到：检测已知的、单个临床可药物抑制剂的靶点，液体活检技术推荐ARMS方法，检测已知的、多个平行临床可药物抑制剂的靶点、液体活检技术推荐NGS方法。所以，从认知程度上讲运用液体活检来指导用药是没有问题的，这很大部分原因是靶向治疗一般用于癌症晚期患者，而此时的ctDNA含量较高，检出率较高。这方面其实又会冒出一系列问题出来：1）临床医生需要在检测基因数目（突变位点数目）（PCR法 vs NGS法）与临床获益之间寻找平衡，有时候只需看一两个基因的状态从而辅助判断特定的靶向药是否能使用，有时候却需要看多个基因的状态而进行整体管理；2） 各公司之间的分析实力有所差异，这表现在有的公司知识更新慢从而不能覆盖较新的有意义突变（罕见突变），有的公司技术实力还未达到可以较准确的分析一些突变类型（如融合）；3）各公司提取与富集ctDNA的技术、灵敏度等技术指标有所差异，同样的样本在不同公司之间检测有可能会有不同的结果。4）基因检测报告专业性不同，但是这方面影响不是特别大，毕竟靶向治疗相关的基因突变是比较少与明确的。举个简单的例子：在非小细胞肺癌（NSCLC）中如果检测到某位患者EGFR 21号外显子发生L858R突变，则可以简单粗暴地推荐他使用第一代EGFR TKI 吉非替尼、厄洛替尼或者埃克替尼，而如果患者的18-21号外显子未检测到任何敏感突变，则不推荐使用第一代EGFR TKI，这是一个最简单指导用药的例子。4，预后监测在临床研究中应用较多，实际临床应用还未成熟。根据目前发表文章来看，这方面应用的较多的是在结直肠癌上。大概的意思是：假设我在某个患者中用ctDNA检测，发现它某个特定突变/ctDNA浓度高，我就认为他活的时间可能不会太长(相较于阴性患者)，也可以说这个患者预后不好。那么动态监测呢：大概意思就是讲，一个患者从诊断治疗开始，我每隔10天（仅举例）就抽你一次血，随着治疗方案的变化、病情发展、肿瘤大小变化，发现ctDNA浓度/某个基因突变有关联变化，那么我们认为它有一定的指示作用。例如有这样的研究（为简单说明，数字做了简化）：100位II期结直肠癌手术患者，50个检测到了ctDNA，而且这50个患者中有40个在27个月内复发了，另外50个未检测到ctDNA，而这50个患者中有40个在27个月内未复发。这确实在科研方面有一定的价值，可是在实际临床应用中还有一定距离。首先，一次检测费用对患者来说是一个问题，其次检测为阳性或者阴性不能100%判断是否会复发，得到一个复发概率较大确实让患者比较郁闷，最后是假设为阳性，医生能够为患者做的事情并不多。此外，在结直肠癌患者中ctDNA可以在影像学变得明显之前发现疾病复发，这就意味着临床医生有机会早期开始治疗或者调整方案。还有一些研究发现：随着化疗方案/靶向药的治疗或者停止，ctDNA浓度/某个基因突变会发生关联性的变化。种种迹象表明：预后监测在结直肠癌中研究比较多，在其他癌种也有研究，临床实际应用还需要一定时间。每一个癌种的情况是不同的，需要分别看待。5，耐药分析：无论是哪种靶向药，患者在使用一段时间后都会变得无效（肿瘤得不到控制而进展），即产生耐药，此时可以通过液态活检来寻找耐药机制。第一种类型是：我们知道患者很有可能发生哪种耐药突变，这时候可以选择基于PCR的方法；第二种类型是：我们不知道患者会发生哪种耐药突变，我们去探索它可能会发生哪种突变，这时候可以选择基于NGS的方法；这一方面的应用在肺癌中比较明显，因为肺癌的靶向药比较多，情况复杂，应用场景也较多。例如：第一代EGFR TKI耐药后，可使用第二代EGFR TKI，若耐药后又发现可药的突变位点，又可使用第三代EGFR TKI；此外，临床研究方面，某个靶向药物耐药后也相继发现一些突变位点（耐药机制）。总的来说：液态活检应用于耐药分析还是比较成熟，临床实践有所涉及、临床研究亦有所涉及。

这些方面有哪些实际应用举例？需要干货？
有待补充。

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