离子交换层析蛋白纯化

病理医师

一、实验原理
离子交换层析（ion exchange chromatography, IEC）是依据流动相中不同蛋白质与离子交换树脂上电荷基团可逆结合力的差异进行分离的。离子交换树脂是一类不溶于水的、惰性的、带有某种电荷基团的高分子聚合物凝胶颗粒。离子交换层析（ion exchange chromatography, IEC）的基本原理是依据流动相中不同蛋白质与离子交换树脂上电荷基团可逆结合力的差异进行分离的。
1. 离子交换树脂的种类：葡聚糖离子交换树脂以 Sephadex G-25 和 G-50 为基质；琼脂糖离子交换树脂以 Sepharose CL-6B 为基质。聚苯乙烯离子交换树脂的基质是苯乙烯和二乙烯苯合成的颗粒，具有机械强度大和流速快的特点，但是具有较强的疏水性，容易引起蛋白质变性，故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。
2．离子交换树脂的离子交换特性：离子交换树脂分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂带负电，可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型。一般而言，结合了磺酸基团（- SO，H），如磺酸甲基（SM）、磺酸乙基（SE）的为强酸型离子交换树脂；结合磷酸基团（- PO，H2）、亚磷酸基团（- PO2 H2）或- 0 - PO2 H2 基团的为中等酸型离子交换树脂；结合酚羟基（- OH）或羧基（- COOH）的为弱酸型离子交换树脂，如羧甲基（CM）。强酸型离子交换树脂对 H＊的结合力比 Na＋ 小，弱酸型离子交换树脂对 H＇的结合力比 Na＊大。
阴离子交换树脂带正电，可以交换阴离子物质。同样可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型。一般结合季铵基团 ［- N（CH3）3］ 的为强碱型离子交换树脂；结合叔铵 ［- N（CH3）2］、仲铵（- NHCH3）、伯铵（- NH2）等的为中等或弱碱型离子交换树脂；结合二乙基氨基乙基（DEAE）的为弱碱型离子交换树脂。强碱型离子交换树脂对 OH 的结合力比 CI 小，而弱酸型离子交换树脂对 OH 的结合力比 CT 大。   



3．离子交换树脂的交换容量：交换容量（exchange capability）反映了离子交换树脂与溶液中蛋白质进行交换的能力。它不仅与所用的离子交换树脂有关，还与实验条件密切相关，一般又称为有效交换容量。如无特殊说明，均指有效交换容量。离子交换树脂的总交换容量用每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（meq/mg 或 meq/ml）来表示。对分离蛋白质的离子交换树脂来说，通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示。
二、实验材料
试剂：NaOH 和 HCI、洗脱液
仪器：离子交换柱、蛋白纯化系统
三、实验方法
离子交换层析的基本过程可分为如下几步：
1．离子交换树脂的选择离子交换树脂的选择决定于目的蛋白的电荷性质。蛋白质通常呈两性电离特性，它们与离子交换树脂的结合与它们的性质以及溶液的 pH 密切相关。
以阳离子交换树脂分离蛋白质为例，在等电点 pl＜pH 的条件下，蛋白带负电，不能与阳离子交换树脂结合；而等电点 pl＞pH 的蛋白带正电，能与阳离子交换树脂结合。一般 pI 越大的蛋白与离子交换树脂结合力越强。强型离子交换树脂使用的 pH 范围很广，所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端 pH 溶液中解离且较稳定的物质。   
交换树脂基质的疏水性会影响目的蛋白的稳定性和分离效果。在分离生物大分子时，应选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都较温和，不易破坏生物大分子的活性。
2．离子交换层析柱的制备离子交换层析柱的制备可参照凝胶过滤层析柱的制备，不同的是离子交换层析柱的长度远比凝胶过滤层析柱短。离子交换树脂使用前，需要用蒸馏水除去杂质，并以 NaOH 和 HCI 处理树脂，使树脂上的官能基团得到完全露出。阴离子交换树脂先以 15 倍于树脂量的 0.5 mol/L HCI 浸泡 30～120 分钟，再用水清洗至 pH7.0，之后用 0.5mol/L NaOH 浸泡 30～120 分钟，同样以水清洗至 pH 7.0，最后浸泡在上样缓冲液中。阳离子交换树脂用 15 倍于树脂量的 0.5 mol/L NaOH 浸泡 30～120 分钟，以水清洗至 pH7.0，之后用 0.5 mol/L HCI 浸泡 30～120 分钟，再以水清洗至 pH7.0，最后浸泡在上样缓冲液。
3．缓冲液的制备若目的蛋白带正电荷，例如细胞色素 C 等碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂；而肝素和核酸等酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换树脂。此外，还要考虑蛋白质在稳定的 pH 范围内带有何种电荷，然后决定交换剂的选择。
4．加样上样时应注意样品液的离子强度和 pH。上样量应由交换容量决定，不宜过大。一般以柱床体积的 1%～5% 为宜，这样，样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。
5．洗脱
（1）洗脱液：离子交换层析中均采用线性梯度洗脱。在洗脱过程中，逐步增大离子强度，从而使与离子交换树脂结合的各个蛋白质组分被依次洗脱下来。改变 pH 的洗脱，对于阳离子交换树脂一般是 pH 从低到高洗脱，阴离子交换树脂则是 pH 从高到低洗脱。洗脱液的选择首先要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离蛋白质组分都是稳定的，其次是要使结合在离子交换树脂上的所有待分离蛋白质组分都能够被洗脱下来。缩小梯度范围可以提高分辨率。
（2）洗脱速度：通常保持恒定洗脱速度。洗脱速度慢可以有较好的分辨率，但有分离时间长、样品扩散、谱峰变宽等副作用。如果洗脱峰相对集中于某个区域，则应缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。
6．离子交换柱的再生对使用过的离子交换树脂进行处理可使其恢复原来的性状，通常的处理方法是酸碱交替浸泡。对离子交换树脂处理的目的是为了使离子交换树脂带上所需的平衡离子。
四、常见问题   
影响交换容量的因素主要有两个：一个是离子交换树脂的颗粒大小和颗粒内孔隙大小。这主要影响离子交换树脂中能与样品组分进行作用的有效表面积，表面积越大，交换容量越高。对于小分子来说，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可以自由进入孔隙；对于较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，因为小颗粒的离子交换树脂可以提供较大的表面积。另一个影响因素是离子强度和 pH，它们可以影响样品中组分和离子交换树脂的带电性质。pH 对弱酸和弱碱型离子交换树脂影响较大。例如，弱酸型离子交换树脂在 pH 较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低 pH 时，电荷基团不易解离，交换容量小。pH 还会影响到样品组分的带电性，尤其是对蛋白质这样的两性物质而言。
一般来说，离子强度增大，交换容量下降。增大离子强度进行洗脱，就是通过降低交换容量将结合在离子交换树脂上的样品组分洗脱下来。



   

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