汇总：流式细胞术常见问题分析

大v

流式细胞术（flow cytometery）是利用流式细胞仪（flow cytometer）对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒等进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析信息全面、分选纯度高、方法灵活等特点，可用于细胞周期、细胞凋亡、细胞功能分析等的检测。
在文献中我们经常能看见美观、简单且一目了然的流式结果分析图，但在实验过程中，我们总会碰到各种问题。“实验技能知多少”系列推文的第四篇，就让我们一起来聊聊让科研小白倍感迷茫的流式细胞术吧。
<hr/>一、流式细胞术简要介绍

1）基本概念：
流式细胞术（flow cytometery，FCM）是一种快速、准确、客观的检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。
2）测量的细胞参数
a. 前向角散射光信号（FSC）：表征细胞相对大小及其表面积
b. 侧向角散射光信号（SSC）：表征细胞粒度及细胞内相对复杂性
3）流式样本的来源
血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手术活检、细针穿刺物、培养细胞系
4）样本性质
新鲜、冰冻、固定保存、石蜡包埋组织
<hr/>二、操作步骤及上机流程

1）流式细胞术应用于生物学研究的主要操作步骤如下：


2）上机检测的基本流程如下：


三、流式细胞术常见问题及分析

1. 无信号/荧光强度弱

● 补偿问题
多色流式配色很关键，低表达的抗原可以用相同荧光素的高表达抗原代替，或者使用补偿微球。
● 用于检测的抗体不足
一定要做抗体滴定，按照说明书的要求加抗体。
● 无法接近细胞内靶标
确定好抗原的表达位置，选择合适的染色方法和刺激方法。
● 激光器未对齐
做实验前一定要确保仪器没有问题。流式细胞仪是流式的三大基本要素之一，要经常维护仪器，做质控，并清洗仪器。确保流式细胞仪上的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查微珠来调整路线。如果激光器未正确对齐或发生偏移，则可能需要考虑维修机器。
● 靶蛋白不存在/低水平表达
确保您正在分析的组织/细胞类型能表达靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被检出。
● 细胞因子类marker
正常的淋巴细胞处于未激活状态，不会分泌细胞因子。因此要选择合适的方法激活淋巴细胞，使其释放细胞因子，达到检测水平。同时要加蛋白转运抑制剂使其留在胞内，然后固定破膜，染相应抗体。细胞刺激剂、蛋白转运抑制剂以及固定破膜的试剂的选择都会影响染色结果。
● 荧光淬灭
抗体可能存放太久或没有避光。还要考虑固定试剂的问题。
● 一抗和二抗不匹配
使用的二抗应与一抗来源种属不同（例如，一抗为兔源，则应该使用抗兔源二抗）。为了解决种属交叉反应性的问题，您可以使用经流式细胞术验证的直接偶联一抗，或者使用偶联物试剂盒，在您选择的抗体中加入合适的荧光染料。
<hr/>2. 荧光强度高

● 抗体浓度过高
做抗体滴定。
● 过量抗体被捕获
胞内染色特有的问题。染色后，充分清洗。也有可能是破膜剂的问题，破膜不够充分。
● 无法接近细胞内靶标
确定好抗原的表达位置，选择合适的染色方法和刺激方法。
● 封闭不足
做Fc受体阻断是一个特别好的流式习惯，但不是所有的细胞都需要做封闭，做封闭是为了减少非特异性结合。
<hr/>3. 背景高/阳性细胞百分比高

● 增益设置过高/补偿过低
使用阳性对照正确设置流式细胞仪，使用补偿减少小颗粒背景信号并减少增益，以降低信号。
● 抗体过量
抗体滴定。清洗充分。
<hr/>4. 在应该只有1个细胞群时观察到2个或以上

● 表达目的marker的细胞群不止一个
做实验前要确定好目的细胞的目的marker。
● 出现细胞双峰
细胞双峰显示为第二大细胞群，其荧光强度大约是单细胞荧光强度的两倍。制样和上机的过程要确保是单细胞悬液，并且过滤掉大的组织团块。
一定要做抗体滴定，按照说明书的要求加抗体。

<hr/>5. 侧向散射背景偏高（来自小颗粒）

● 细胞裂解
制样问题，保证细胞的活力，不能有太多碎片。注意离心条件和涡旋力度。
● 细菌污染
确保样本不受污染。细菌会自动发出较弱的荧光，导致高事件率。
● 去死活
样本制备不可避免的会出现细胞死亡或坏死，特别是实体组织制备的单细胞悬液，一定要染死活，不染自发荧光会很高，干扰实验结果。
<hr/>6. 其他

● 细胞量
正常1×106个细胞/100 μL体系中染色。表达量高的膜表面分子可以体系减半抗体减半。固定破膜的过程中，会损失掉一些细胞。因此，表达量低、胞内、核内分子可以加大细胞量，相应体积的抗体也可以对应细胞量多加，一定要做预实验和抗体滴定，摸索最佳染色效果。
● 电压
裸细胞调完FSC、SSC的电压，记得调荧光通道的电压。
● 对照
一定要设置好对照组，补偿对照、阴性对照、阳性对照（生物学对照）、同型对照、FMO对照。
● 细胞聚集，阻塞管道
制样的过程中一定要确保是单细胞悬液，制样和上机的时候过滤掉组织团块。
● 固定
某些荧光素对多聚甲醛敏感，要注意，可以选择成品、温和的固定液。如果固定过夜，上机前要清洗掉多聚甲醛再上机。
<hr/>最后提醒大家：一定要做预实验和抗体滴定，把所有的对照都设置好，预实验尽可能排除掉所有可能出现的问题，稳定条件，甚至可以再流式细胞仪上设好panel，再上大规模的实验！

往期高赞内容推荐：

合集 | SCI论文最标准的Figure图处理规范（含详细工具）
科研绘图王炸：最全矢量素材免费网站/软件合集！
科研画图都用什么软件？
ImageJ定量分析 WB 灰度值（详解版）
赛尔普生物：9个Western Blot工具，帮你搞定实验最关键的一步！
如何查看国家自然科学基金的的摘要和下载结题报告？
赛尔普生物：查询历年国自然科学基金项目？这8个网站必看！
免费好用的PDF编辑器，推荐一下?
白嫖这12个插件，让你的Zotero成为地表最强文献管理器！
赛尔普生物：强推ScienceSlides！好用到离谱的科研插画神器！
endnote x9 激活版下载！
生信分析入门 | 看完别说你不会生信了

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/659849359