你想要的Western Blot来了！(纯干货)

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蛋白印迹实验(Western Blot)，作为医药学专业学生必备科研生存技巧，尽管步骤及操作并不是很复杂，但各路大神却常常拜倒它的魔爪之下，堪称科研路上的第一大玄学！为此，通过详细解析它的步骤及常见问题，希望对大家的科研之路起到帮助！


原理：Western Blot采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用抗体(一抗)与抗原(待测蛋白)发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白，经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,把这个过程称为电泳印迹。值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉对膜进行“封闭”而防止抗体与膜的非特异性结合，最终来考察蛋白表达情况。
常见步骤：
  细胞接种：细胞以1–2x10^6 cells/孔细胞浓度接种于6孔板中，孵育过夜。
  给药：若需化合物干预，将化合物母液稀释至培基中，替换旧培基，药物干预一定时长。
  消化：弃掉培基，PBS洗涤细胞两次，胰蛋白酶消化收集细胞。细胞悬液1000 rpm离心3 min。弃掉上清液后，PBS洗涤细胞两次。
  裂解：细胞裂解物被裂解缓冲液提取，并在14000 g转速下离心10 min，取上清。
  蛋白定量：BCA试剂盒对蛋白浓度进行定量。
蛋白变性及分离：定量蛋白溶液在1×loading buffer中于95 ℃下煮沸10 min, 随后在SDS-PAGE凝胶中分离。
转膜：甲醇活化PVDF膜，凝胶在转印槽中被转印到PVDF膜上。
  封闭：蛋白条带被5%脱脂奶粉或BSA封闭1 h，1×TBST洗涤条带三次。
一抗与二抗：条带于一抗稀释液下4 ℃孵育过夜，1×TBST洗涤条带三次。条带于二抗稀释液下室温下孵育1.5 h，1×TBST洗涤条带三次。
  显色：蛋白条带于自动发光分析仪中化学发光液下进行可视化。
实验操作注意事项总结：
1.裂解：细胞裂解后提取出鼻涕状物质，基因组DNA是导致鼻涕状上清的直接原因。解决方法，多加一些裂解液可以起到缓解作用；超声破碎仪处理3–5秒，适度超声一下，打碎DNA，尽量不要损伤蛋白。
PMSF(苯甲基磺酰氟)是一种丝氨酸蛋白酶不可逆抑制剂。其溶于水且在水溶液中非常不稳定，容易分解，因此提取蛋白时每一步都要加入新鲜的PMSF，样品处理超过1h，补加一次。
2.蛋白定量：建议定量过程中多稀释几个浓度(如5倍、10倍及20倍等)且设置复孔。只有定量相对准确，才能保证你后期结果的可信度和可重复性。
3.蛋白变性：定量蛋白在高温煮沸中，肯定会有小伙伴有忘记煮沸时间的经历，其实只要时间不是太久，蛋白在一定时间变性后，仍然可以使用。但还是希望大家尽量控制在10 min之内。
4.转膜：正如大家常用的半干转和湿转两种方法。半干转和湿转两种方法各有优点。对于需要加长时间进行转移的大蛋白而言，湿转移更适合。而半干转移技术优点则体现在更快地完成转移，消耗的缓冲液少，同时，对于做实验比较挑剔的人而言，他们觉得半干转的流程也会相对干净。
摆放顺序: 半干转移：纸>凝胶>膜>纸(均用转移缓冲液浸湿)；
              湿转移：海绵>纸>凝胶>膜>纸>海绵(全程在转移缓冲液中浸泡)。
5.封闭：蛋白条带的封闭一般选择脱脂奶粉或BSA。Western Blot实验的灵敏度某种程度受限于封闭做的好不好。封闭时间不够，可导致高背景条带的出现。同时，脱脂奶粉成分复杂(多种蛋白质的混合物)，磷酸化抗体可能会导致背景增加。另外，因为自身含有生物素，脱脂奶粉不能用于生物素标记的抗体系统。
常见蛋白条带问题及解决方案：
蛋白条带呈现高背景：
1.封闭时间不足
解决方案：增加封闭时间和/或温度，增加封闭剂的浓度(尝试增加至10%)，更改封闭剂(脱脂牛奶或BSA)，在抗体缓冲液中加入封闭剂(也可增加封闭剂浓度)。
2.抗体浓度偏高或二抗非特异性着色
解决方案：降低一抗或二抗的浓度，在抗体缓冲液中加入封闭剂，做去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。
3.洗涤不充分，非结合抗体未完全洗净
解决方案：需要增加洗膜次数和/或洗膜时间。
4.干膜
解决方案：确保膜在WB实验过程中不会变干。
5.曝光时间过长
解决方案：降低曝光时间，设置不同的检测时间点，逐步曝光。
6.检测试剂太灵敏
解决方案：在纯水中稀释检测试剂或使用灵敏度较低的检测试剂。
7.转膜液或封闭液等不新鲜或被污染
解决方案：转膜液使用尽可能别超过2次，封闭液最好现用现配。



高背景条带

非特异性条带：
1.抗体浓度偏高或二抗非特异性着色
解决方案：降低一抗或二抗的浓度，在抗体缓冲液中加入封闭剂，做去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。在引起高背景的同时，非特异性条带同样会产生。
2.抗体孵育时间过长
解决方案：降低抗体的孵育时间，可做时间梯度，根据显色结果选择合适的孵育时间。
3.所检测蛋白聚合
解决方案：提升上样缓冲液中DTT(20-100 mM)的含量，充分降低二硫键的形成。
4.所检测蛋白降解
解决方案：最大限度降低所测蛋白溶液的冻存次数；样本冻存前加入蛋白酶抑制剂；尽可能使用新鲜样本。



非特异性条带

无条带或条带很浅
最终显色环节没有条带或条带很浅，可归结于一抗二抗不适配；抗体长时间使用失效；样品中没有想要检测的靶蛋白或含量极少。
解决方案：更换合适的一抗二抗(可更换大品牌抗体去做重复验证)；使用丽春红染色排除转膜问题。
微笑条带
电泳条带或整体出现“︶”形状，可能原因主要包括两方面。一是电泳速度过快。二是电泳温度过高，使得胶变形；三是电泳过程中电压过高。
解决方案：可通过减少电压等减慢电泳速度；可在冷室或者冰浴中进行电泳或者改变电泳pH。



微笑状条带

皱眉条带
与微笑状条带相反，条带成现“︵”皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。主要出现在蛋白质垂直电泳槽中。
解决方案：可通过调整装置及在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。



皱眉状条带

某条条带变形
WB结果中其它条带均正常，某条条带出现变形, 出现该现象可能的原因是SDS-PAGE胶中有气泡或不溶性颗粒。
解决方案：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。



条带变形

哑铃状条带
结果中出现条带呈现哑铃状，该现象可能有两个原因导致。一是由于配置胶有问题，胶凝固后不均一。二是样品可能含有过多杂质。
解决方案：通过重新配置胶，确保胶质量无问题来避免该现象出现；在样品使用前对其进行离心，以去除过多杂质
条带粘连
条带粘连是不同孔目标条带连在一起，中间无间隔。出现该现象的原因可能是上样量太多，或者是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品出现串孔现象。
解决方案：可通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。



条带粘连

条带中间白圈可能是由于电转中膜和胶之间存在气泡。
解决方案：在转膜过程中，使膜、滤纸和胶紧密结合，尽量赶除气泡。在转膜装置组装时，建议可把胶完全置于转膜液中进行。同时，抗体孵育的过程中，保持膜的充分浸润。



条带出现白圈

条带拖尾
蛋白样品的溶解度不好；电泳缓冲液重复使用次数过多；分离胶的浓度过大；样品降解。
解决方案：样品上样前离心，寻找合适的裂解液；电泳缓冲液建议使用三次以内，尤其转膜液建议使用两次后尽可能更换；根据分子量的大小，选择合适的分离胶(参考蛋白分离试剂盒说明书)。



条带拖尾

总结
Western Blot是一个需要极其细致化的实验，每一步都需要大家仔细斟酌和考虑，protocol的完善及每次结果的分析总结会帮助到大家避免许多不必要错误的出现。蛋白印迹实验的其他注意事项后期仍然会不断分享，祝大家跑胶之路顺利！

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