细胞表型检测实验有哪些？

生物科研实验室

细胞表型乃是涵盖基因及蛋白表达的多个细胞进程的聚合体，此类进程致使细胞具有特定的形态与功能。细胞表型的检测，所检测的乃是如下一系列表型：周期、增殖、凋亡、迁移、侵袭、克隆形成、自噬、EMT（上皮间充质转化）、血管生成。于细胞内部，将某一目的基因进行敲除、敲降、过表达，构建稳转株之后，与对照细胞一同，展开细胞表型的检测，察看每一项表型的变化，便可推断出该目的基因的功能。细胞周期   细胞周期是指细胞从一次分裂结束开始，到下一次分裂结束所经历的过程。细胞周期包括以下几个阶段：G1 期：细胞生长和合成代谢活跃的时期，为进入 S 期做准备。S 期：进行 DNA 合成的阶段。G2 期：进一步合成细胞所需物质，为分裂做准备。M 期：即有丝分裂期，细胞发生染色体分离和胞质分裂。碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一种核酸染料，可透过凋亡中晚期的细胞和死细胞，嵌入核酸DNA或RNA双链螺旋的碱基之间，使细胞核红染，并且荧光强度和所嵌入的核酸含量成正比。细胞周期检测时，首先用RNA 酶将RNA消化排除影响，通过流式细胞术检测PI荧光强度直接反映细胞各时相的DNA分布状态，从而计算出各时相的百分率。细胞增殖细胞增殖实验是一类用于评估细胞生长和分裂能力的实验方法。检测增殖情况研究细胞的生长特性和生物学行为，评估药物或其他处理因素对细胞增殖的影响，筛选具有增殖调节作用的化合物，了解细胞信号通路和基因调控对增殖的作用。通常细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平台期，然后退化衰亡。可以用存活细胞数（万/mL）对培养时间（h或d）作图，得到生长曲线，可准确描述整个过程中细胞数目的动态变化。目前主要使用MTT、CCK8和Am-blue三种试剂测定细胞生长曲线。细胞迁移细胞迁移指的是细胞在接纳到迁移信号或是感知到某些物质的梯度后所出现的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延展、新的黏附建立以及细胞体尾部收缩于时空上交互进行的过程。细胞迁移作为正常细胞的一项基本功能，属于机体正常生长发育的生理流程，亦是活细胞广泛存在的一种运动形式。在胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化以及癌症转移等过程里均涵盖了细胞迁移。检测细胞迁移能力的实验包含划痕实验与 Transwell 实验。细胞划痕实验即于体外培养皿抑或平板培养的单层贴壁细胞上，借助微量枪头或者其他硬物在细胞生长的中央区域划出线条，去除中央部位的细胞，接着持续培养细胞至实验设定的时间，对细胞进行观察。Transwell 的基本原理为把 transwell 小室放置于培养板中，小室被称作上室，培养板内则称为下室，上下层培养液通过聚碳酸酯膜相隔，在上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。将细胞种植在上室内，鉴于膜具有通透性，下层培养液中的成分能够作用于上室内的细胞，如此便能研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。细胞侵袭细胞侵袭实验的目的是研究趋化因子或其他营养物质对细胞侵袭的影响。将细胞种于上室，趋化因子等种于下室，细胞会向营养成分高的下室跑。与迁移实验不同是侵袭实验需要在小室聚碳酸酯膜上铺设一层基质胶。用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。细胞凋亡细胞凋亡是指在特定的生理或病理状况下，细胞依照自身的程序，自行终结其生命的过程。这是一个主动、高度有序且由基因控制，并有一系列酶参与的过程。磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）通常处于细胞膜的内侧，然而在细胞凋亡的初期，PS 会从细胞膜的内侧翻转至细胞膜的表面，展露在细胞外的环境当中。把标记有荧光素或者 biotin 的 Annexin V（一种 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与 PS 具有高亲和力且能特异性结合）与 PC 结合，通过流式细胞仪或者荧光显微镜，就能够检测到细胞凋亡的发生。将 Annexin V 与 PI 配合使用，便可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞予以区分。克隆形成克隆形成是测定细胞增殖能力的有效方法之一。单个细胞在体外持续6代以上，其后代所组成的细胞群称为克隆。这时每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖能力和独立生存能力。常用的方法有：平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。悬浮细胞克隆形成检测可使用软琼脂克隆形成实验。细胞自噬细胞自噬是通过溶酶体进行蛋白降解和细胞组分调节的过程。自噬主要受细胞内的营养匮乏刺激而产生，在生物体内发育、分化、环境胁迫和肿瘤发生中具有重要的意义。研究发现微管相关蛋白轻链3（MAP-LC3），简称LC3，参与了自噬的形成，并被证明了是哺乳动物细胞中常见的自噬小体标记蛋白之一。可在细胞中表达LC3-GFP融合蛋白，对自噬体的形成和功能进行监控。细胞自噬的调节机制复杂，受到多种信号通路和分子的调控。细胞自噬作用：物质循环和能量利用：分解和回收细胞内的多余或受损成分，提供能量和物质。细胞稳态维持：清除异常蛋白质、细胞器等，保持细胞内环境稳定。应激适应：在应激条件下，如营养缺乏、缺氧等，提供生存所需的物质和能量。免疫调节：参与免疫应答，清除病原体。肿瘤发生：与肿瘤的发生、发展密切相关。因此，可在相关疾病研究中检测自噬，研究基因功能。EMTEMT，指上皮细胞-间充质转化的缩写，是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。通过Western Blot的方法检测细胞中目的基因敲降或过表达后EMT marker蛋白表达量，可判断目的基因表达变化后是否能抑制EMT过程的发生，从而判断该基因是否为转移相关基因。血管生成血管生成是指从已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉中产生新的毛细血管性血管的生长过程。不论是原发性肿瘤还是继发性肿瘤，只要其生长直径超过 1 至 2 毫米，就都会出现血管生成的现象。这是因为肿瘤细胞自身能够分泌多种生长因子，从而诱导血管生成。体外血管生成实验能够较好地模拟肿瘤血管的发生过程，并且适宜研究某些基因或药物对于这一过程的作用。能够借助血管内皮细胞（HUVEC）在基质胶（Matrigel）上形成血管的能力，来判定某些基因或药物对血管形成的影响。