实验技巧 | RNA-FISH

乔帮主

在基础科研领域，mRNA、IncRNA、circRNA、miRNA是科研界的宠儿，吸引着无数科研狗们前仆后继。打开pubmed搜索RNA的文章，许多篇都有RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）的身影，然而受限于实验仪器，技术或者经费的影响，对于一些硕博生们，RNA-FISH始终如那海市蜃楼，可望而不及。没关系，今天科研狗小助手带你手把手做RNA-FISH。
一、原理
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种利用荧光标记的核酸片段为探针，与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，通过荧光检测系统将待测核酸在组织、细胞或染色体中的位置显示出来的技术。
如果待检测的细胞或组织切片上的靶核酸与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶核酸与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素或直接标记荧光素，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应或直接经荧光检测体系在镜下对待测核酸（mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA）进行定性、半定量或相对定位分析的一种实验方法。
二、实验步骤
1、样本准备
（1）载波片处理
1%盐酸酒精充分浸泡盖玻片，加盖，浸泡 1h 以上。流水冲洗盖玻片（控制流速，勿冲出盖玻片)；灭菌双蒸水洗4-5遍，室温，振荡洗涤；无水乙醇泡3次，每次数分钟；倾去乙醇，放入温度为60°C左右烤箱烘干数小时，高压灭菌烤干；
（2）收获分化不同时期细胞。
2、固定及透化
（1）1X PBS 洗一次细胞；
（2）室温，4%多聚甲醛固定10 min；
（3）1X PBS洗细胞，3次，每次 1min；
（4）每孔加入1ml预冷的通透液，置于4度冰箱，5min；
（5）弃去通透液；
（6）1X PBS洗细胞，3次，每次加入1ml。
3、检测细胞或组织中的RNA
（1）用钻石笔在切片背面圈定用于原位杂交的范围；
（2）杂交前，先将切片置于约200ul预杂交液中封闭，20-25度，20min；
（3）同时，将杂交液预热于同上温度中；
（4）在探针混合液稀释好待用前，不要将预杂交液从切片上弃去；
（5）切片需置于湿盒中；
（6）杂交1小时，所用温度与预杂交温度相同，每张切片用 100-300ul的杂交液，应当小心吸取杂交液于切片上，确保杂交液充分覆盖切片；
（7）用洗液I洗片，3次，每次5min，所用温度与之前相同，需避光；
（8）用洗液II洗片，1次，5min，所用温度与之前相同，需避光；
（9）用洗液III洗片，次，5min，所用温度与之前相同，需避光；
（10）最后，用1X PBS洗片，1次，5min，室温，需避光。
4、核染
（1）加入DAPI溶液，避光孵育5min；
（2）用1X PBS洗片，3次，每次5min，室温，需用摇床。
5、封片
（1）弃去PBS，加入封片液，用盖玻片盖好，将切片竖立 2min 以使其干燥，需避光；
（2）加入防荧光猝灭剂，用指甲油封片，避免起泡。
6、图像采集
激光共聚焦荧光显微镜下观察，进行图像采集。
7、数据处理
进行数据处理。

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