一份送给新手的ELISA指南

Rose

实验原理：

ELISA是酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的简称。利用抗原抗体的特异性反应原理。将抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。


分类：

ELISA可同时用于测定抗原和抗体。根据ELISA实验原理及操作的不同，可以将ELISA大致分为四种：直接法、间接法、夹心法和竞争法。
各法的原理和优缺点，可参考往期内容《ELISA实验原理及操作步骤》
包被和封闭的原理：

实验时，需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上，通过检测分子（酶或荧光基团），将化学信号转换为电信号，以OD值或发光值的结果，对靶蛋白进行定量分析。
ELISA 中的固相载体物很多，最常用的是聚苯乙烯，具有较强的蛋白质吸附性。具有可制成各种形式，且不参与化学反应的特点。与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯，它质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜；另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的。
在 ELISA 中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键。ELISA 所用抗原有三个来源：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化。重组抗原和多肽抗原均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，干扰少的优势。但制备的技术难度较大，制备成本高。
将抗原或抗体固相化的过程称为包被。因为载体的物质不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯 ELISA 板为载体时，需将抗原或抗体溶于缓冲液中，加于 ELISA 板孔中在 4℃ 过夜。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面能被此蛋白质完全覆盖，后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色，导致本底值偏高。在这种情况下，需要在包被后用牛血清白蛋白再包被一次，消除干扰，这一过程也被称为封闭。
通常包被和封闭都是在生产时由厂家完成的，只需要知道原理即可，实验时无需操作。
试剂盒挑选

新手在挑选ELISA试剂盒时。尽量选择正规渠道正规厂家的试剂盒，无论是产品还是技术以及售后都能够有很好的保障。遇到不常见的指标尤其需要注意。最好选择文献引用多的品牌，SCI文献的引用数量最具参考价值。
更多试剂盒厂家挑选原则可参考往期内容《如何选择ELISA试剂盒》。
在挑选试剂盒时，需要注意哪些信息呢？以下以Elabscience官网展示信息为例。


首先，在搜索框中输入自己想要检测的蛋白指标。注意蛋白名称是否正确，有些蛋白有别称，当直接搜索不到时，可以查找别称后搜索。需要注意时，有时蛋白指标相同，但不是同种蛋白，注意用别称来甄别。
其次，需要注意反应性物种（即应用种属），除个别指标能够通用外，大部分试剂盒只能针对一个种属检测。
然后注意检测范围。根据查阅文献的信息，了解检测的指标表达量大致是多少。尽量选择表达量在检测范围内的试剂盒。当没有恰好合适的试剂盒时，我们也可以选择检测范围小于目标蛋白的试剂盒。
最后是规格、数量和货期的信息。需要根据自己的样本数、重复数来选择。注意每板需要预留两排（即16孔）用于标准曲线的制作。至于货期，如果时间充裕的话，可以不用考虑。
实验设计

建议将96微孔板的前两列设置为标准品点样孔，同时设置8个梯度浓度，2列复孔，将标准品工作液由低浓度到高浓度、依次从下至上加入酶标板中。
微孔板条的后10列可设置为待测样品点样孔，一般设置2~3个复孔。根据实验需求，可设置正常组、模型组、治疗组等。根据文献中的查出的蛋白，选择是否稀释样本以及样本稀释的浓度。


实验操作

最后，我们按照说明书上的内容，即可完成点样和后续操作啦。不同的试剂盒实验操作步骤不完全相同，耗时也有长有短。在实验时，注意时间安排。最后再进行上机和数据分析就完成啦！

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