流式细胞术最全攻略：从protocol到问题解决

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直接上图！


文献中我们经常能看见这种图，也就是流式结果分析图，美观、简单、一目了然。
流式细胞术（flow cytometry）是20世纪60年代后期开始发展起来的利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选细胞的新技术，主要分为流式分析和分选2部分。

今天我们主要介绍流式分析中基本操作与技巧，首先简要了解一下什么是流式细胞术。

一、流式细胞术的3大要素
1. 流式细胞仪：现在市面上有多种型号的流式细胞仪，但其基本结构都是相同的，分析性流式细胞仪有液流系统、光路系统、监测分析系统。
（1）液流系统
  




（2）光路系统
光路系统始于激光器，其分类分法很多，最常用的分类方法是根据其发射的激光的波长来分，如常见的有488nm的蓝激光器、635nm的红激光器和405nm的紫激光器，不同的激光器发出的激光照射到细胞后产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收。
流式细胞仪采集的光信号包括散射光信号和荧光信号，散射光信号也就是我们常说的FSC（前向散射光，反应细胞的大小）、SSC（侧向散射光，反应细胞的复杂程度）；荧光信号是细胞上结合有荧光素，被激光激发以后，会发射荧光信号。
  



（3）检测分析系统：
流式细胞仪的检测分析系统就是以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析，最后得出样品群体中细胞的物理化学特征。
通道，我们可以理解为就是光电倍增管，有2个作用，①将光信号转变为电子信号；②放大电子信号。可以分为散射光通道（FSC通道、SSC通道）和荧光通道，一个激光器下可以有多个荧光通道，一个通道对应多个荧光染料，例如以beckman的DXflex机器的638nm红激光器为例，APC通道可以接收 APC、Alexa Fluor647、eFluor660荧光信号，原则上，这3种荧光素不能同时标记一个样品，否则，就无法分析该通道上的信号是来自于哪种荧光素。
另一个重要组成部分就是计算机分析系统，例如BD的DIVA系统。
  



二、样品细胞：流式细胞术检测的对象一般是细胞，并且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，如果要检测组织中的细胞，必须先将组织制备成单细胞悬液。

三、荧光偶联抗体：样品细胞只有标记荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号，从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱等情况。

二、流式细胞术的基本操作与技巧
  




以体外培养的PBMC细胞为例：
1、细胞培养在96孔板中，直接收集细胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C离心5min，弃上清；
2、然后用1ml FACS buffer重悬沉淀，350g，4°C离心5min，弃上清；
3、封闭：标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体，其基本结构都由两部分组成，即包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段，抗体的特异性表现在Fab段，标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异性结合，从而标记并且相对量化细胞表达该抗原分子的情况。但是，有些细胞表面表达FcR(Fc receptor, Fc受体），如巨噬细胞、DC、B淋巴细胞等， FcR可以与荧光素偶联抗体的Fc段进行非特异性的结合，对结果产生一定的影响。

封闭方法1：
取适量的血清全IgG抗体与样品细胞充分混匀，4'C静置 15min。研究人的细胞时，若荧光素偶联抗体来源于小鼠，封闭采用小鼠血清全IgG抗体。 原则是，如果流式抗体可能与样品细胞的FcR发生非特异性结合，那么在标记荧光素偶联抗体之前先用流式抗体同源的全IgG抗体进行封闭，使样品细胞表面的FcR饱和。

封闭方法2：
适量的抗CD16和抗CD32单克隆抗体与样品细胞充分混匀，4'C静置 15min。CD16是一种FcR, 能够与IgG的Fc段结合，亲和力较强； CD32也是一种 FcR, 能够与IgG的Fc段结合，亲和力中等。 而荧光素偶联抗体基本上是IgG抗体，所以在标记荧光素偶联抗体前可以用抗CD16和抗CD32单克隆抗体封闭样品细胞，使样品细胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32单克隆抗体结合，从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。
  




4、标记相应的荧光素偶联抗体，这里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC为例，一般染色体系推荐100μl，CD3、CD4表达量相对较高，1μl足够了，假如有9个样本，分别取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混匀后，分别取100μl加到9个样品孔中，混匀，室温、避光染色20min；
5、加1ml FACS buffer洗去未结合的抗体，350g，4°C离心5min，弃上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重悬沉淀，尽快上机分析。
6、电压的设定：上机分析时，确认机器没有问题后，首先就是调节每个通道的光电倍增管的电压，目的是为了区分细胞群，假如我们想研究人的淋巴细胞群，我们都知道人的PBMC含有淋巴细胞、单核细胞还有中性粒细胞等，那我们怎么把它们分开呢？这时候就要用到我们前面提过的FSC和SSC，通过调节FSC和SSC的电压，区分淋巴细胞亚群，原则就是使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的电压确定之后就开始调节APC-cy7、FITC的电压（我们可以在铺细胞的时候多铺一个孔，染色时将CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC电压的调节），原则就是使阳性细胞群和阴性细胞群尽可能的分离。
  




7、对照的设置：
流式实验中对照设置很重要，常见的有阴性对照、FMO对照、补偿单阳管对照。
（1）阴性对照：每一种细胞都会产生非特异性荧光，流式检测时得到的荧光信号是细胞本身的非特异性荧光和来自于细胞表面结合的荧光素的特异性荧光叠加得到的结果。所以，确定与荧光素无关的细胞自身的非特异性荧光的强弱非常重要，此时就需要设立阴性对照。下图3类阴性对照是比较全面的阴性对照，但我们实验中设置阴性对照不需要3种阴性对照全部设置齐全，一般只需要设置1种阴性对照就可以了，推荐第1类或第3类。
①  第1类"negative"表示 的是不加任何荧光素偶联抗体时得到的荧光信号，即“blank”因为没有标记任何荧光素，所以这组得到的荧光信号与荧光素无关，与细胞抗原分子是否表达无关，得到的荧光信号代表的是非特异性荧光信号（当实验要求不高、已进行预实验或者能够确定同型对照的荧光信号与不加同型对照的这种阴性对照结果一致时，就可以采用这种阴性对照的设置）；
②  第2类“抗CD69"表示的是用抗CD69抗体标记样品细胞后得到的荧光信号，虽然抗CD69抗体能够与细胞表面的CD69抗原分子结合，但是抗CD69抗体没有偶联荧光素，所以得到的荧光信号也与细胞表面是否表达有CD69分子无关，得到的荧光信号代表的也只是细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除抗体的影响（第2种阴性对照设置方法只是一种理论上的设置方法，是为了便于理解阴性对照的设置原理，一般流式分析时不会应用到这种阴性对照）；
③  第3类"IgG1-PE"表示的是标记与抗CD69抗体同种属（来源于同一物种）且同类（抗CD69-PE中的抗体是IgGl类的）的非特异性抗体(IgGl)与PE荧光素偶联的同型(isotype)对照抗体(IgGl-PE)后，得到的荧光信号，这种同型对照抗体不能与细胞表面的CD69 发生特异性结合，所以细胞表面不会结合有IgGl-PE, 最后得到的荧光信号不是PE荧光素产生的特异性荧光信号，而是代表细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除荧光素的影响（第3种阴性对照的设置方法，称为同型对照设置，是常规的阴性对照设置法，正式的流式图的数据都必须建立在这种同型对照的基础之上，在同型对照基础上得出的流式结果是最可靠的，尤其是对于一些阴阳分群不明显的情况下，可将同型对照作为划门的依据）。
  




（2）FMO（fuorescence-minus-one control）对照：即减去一个荧光抗体（一般是表达量低、背景荧光干扰强），其它组合不变，是一种特殊的阴性对照，多在研究不同细胞亚群表达某些重要的表型分子、细胞因子等时应用。如Foxp3 FMO，也就是不加Foxp3-PE，只加入CD4、CD25，与三个染料都加组相比，多出来的那部分就是Treg细胞群。
  




（3）补偿单阳管对照:以上面我们提到的CD3-APC、CD4-FITC为例，在这里，我们要设置PE单染管和FITC单染管，用于补偿的调节，一般单染管要求有明显的阳性细胞群，像CD3、CD4表达量都很高，阳性细胞群明显，但对一些抗原表达弱的情况（阳性细胞群基本看不到），例如CD25，这时候有必要借助补偿微球。
  



总结
常见对照的作用
作用
阴性对照- negative、全染调节FSC/SSC及荧光通道的电压
补偿单阳管对照调节补偿
阴性对照-同型(isotype)对照精准圈门
FMO对照精准圈门

三、注意事项
（1）在细胞制备、培养阶段，如果该培养细胞是贴壁细胞，需用先用胰酶消化细胞，然后收集待测样品细胞，离心、洗涤、封闭后标记荧光素偶联抗体即可。
（2）如果是胸腺、脾脏和淋巴结等外周免疫器官，主要由免疫细胞组成，制成单细胞悬液，只需直接将脏器经钢网研磨即可。
（3）如果是实体脏器肺脏、肝脏和肿瘤组织内含有较多的结缔组织，实体脏器细胞之间一般结合紧密，所以直接研磨脏器法无法得到理想的单细胞悬液。因此，研磨前需将脏器剪碎后加入IV型胶原酶和DNA核酸内切酶消化，消化后的组织再用研磨棒直接研磨。实体脏器研磨后的单细胞悬液以实体细胞为主，如果研究目标不是实体细胞，而是脏器内浸润的免疫细胞，可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞，然后再进行流式分析。
（4）调节电压时，如果检测的目标细胞体积较小，可以适当提高电压值，使目标细胞与细胞碎片在流式图中能够完全分离；如果检测的目标细胞体积较大，可以适当降低电压值，使所有的目标细胞群完整显示于流式图中，防止细胞群接近于流式图的边界而变形扭曲或者完全处于边界外。
（5）关于样本的封闭，并不是标记荧光素偶联抗体之前必须封闭样品，一般样品细胞与流式抗体的种属来源是不同的，如标记人的细胞的荧光素偶联抗体一般来源于小鼠，人细胞的FcR也不一定能够与小鼠来源的荧光素偶联抗体的Fc段结合，但是，也有可能因为种属关系较近，或者在一定环境条件下这种不同种属间的Fc段和FcR也能结合，实验者很难判断实验过程中这种结合是否会发生，但是在标记荧光素偶联抗体前封闭样品却可以保证这种非特异性结合一定不会发生。所以，条件允许的话，实验者最好养成封闭样品的习惯。


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