如何进行 PCR 实验？

HaHa

如何进行 PCR 实验？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/636940856

同花顺

1获取组织。
2消化：30μL消化液（含有NaOH）。
PCR：98℃ 1h，4℃ ∞。
3终止消化：30μL终止液（Tris HCl pH5.5）离心混匀，得到模板。
4PCR：按自己的需求来。
引物（上游引物+下游引物（又叫反向引物），Forward primer+Reverse primer）
5跑胶：上样10μL，琼脂糖凝胶浓度：1.5%-2%，常用1.5%。DNA marker 上2-3μL（一般上样2μl）。wb电泳的时候marker上样1-2μl（一般上样2μl）。
电泳：120V，20min，记得观察电泳开始时，正负极是否产生气泡，保证连接成功。
胶用1×TAE缓冲液稀释。1×TAE缓冲液：将50×TAE缓冲液用纯水稀释50倍。
配胶：将1×TAE缓冲液倒入洗净的锥形瓶中，再加入称量好的琼脂糖，尽量不要沾到上壁，摇匀后放入微波炉，中高火2min，观察是否变得透明无色，无胶沉在底部，时间不够可以再“叮”1min,直至变为透明无色。用卷好的吸水纸包住，以防烫手，在冷水中摇晃降温直至不烫手，加入核酸染料，只要看得出颜色变棕即可，用量不需十分精确。
核酸染料（goldview）比例为1:20000。
例如：配胶90mL
90mL 1×TAE+琼脂糖90×1.5%=1.35g
+核酸染料1:20000×90000=4.5μL。
30mL：-琼脂糖0.45g-核酸染料1.5μL
60mL：-琼脂糖0.9g-核酸染料3μL
90 mL-琼脂糖1.35g-核酸染料4.5μL
120 mL：-琼脂糖1.8g-核酸染料6μL
150 mL：-琼脂糖2.25g-核酸染料7.5μL
全程约1h9min30s，预约仪器2h，4℃之后会infinite hold，留在PCR仪中，也可以拿出来震荡，离心，不跑的话放在4℃，拿出来必须震荡离心，在盖子上容易挥发掉。
以上为基因型鉴定的PCR，如果需要做荧光定量PCR，我之前发过一个，可以看一下。

检验医师

什么是聚合酶链式反应呢，聚合酶链式反应也就是我们常说的PCR技术，PCR最早出现在二十世纪八十年代，Mullis发明了简易DNA扩增法，这项发明代表着分子生物学领域的一个突破，意味着PCR技术的真正诞生。PCR技术的核心是根据DNA半保留复制原理，即将双链DNA 打开，进行半保留复制，获得产物。在体外就可以实现目的基因片段放大扩增，将微量的DNA大幅的扩增。PCR技术不仅具有高灵敏度，快速简便[1]，还具有重复性好，产率高等优势，因此使用范围极广。
       在整个反应中，需在酶反应的情况下，根据目的基因片段的长短、GC含量设置不同变性、退火、延伸温度和时间的技术[2]。在实验开始前，我们需要准备好模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP以及含有Mg +的缓冲液[3]。模板DNA的来源可以是任一物种的组织、细胞，通常在准备模板DNA的时，会经过氯仿、酚类试剂的抽提纯化，使用乙醇沉淀后获得纯净的模板，PCR反应体系中的模板应是不含杂质的。若以RNA为例，首先我们要得到纯净的RNA，如图，


       可以从图中清晰的看到8S、18S和5S三条带，然后再将RNA反转录为cDNA，作为PCR反应体系中的模板。
      特异性引物则是根据我们目的基因的序列设计的两条引物，即3’端和5’端引物，每条引物的长短在18-6bp之间，G+C含量在40-60%之间效果最佳，上下游引物内部避免有二级结构，防止引物间互补。PCR反应体系中，可以根据下游实验的需求选择不同的DNA聚合酶，如:后续实验对保真度要求高，我们就应该选择高保真酶。PCR反应体系中，缓冲液中的Mg +能影响反应的特异性和扩增片段的产率，因此，要选择合适的buffer。最后，要设置反应温度和循环次数，首先变性的温度在90-96℃之间，时间一般为30s，退火温度则是低于引物Tm值5℃左右，一般在45~55℃之间。延伸温度要根据目的基因的序列决定，延伸时间则是根据酶的合成速度和片段长短有关，
公式:Tm值=4(G+C)+(A+T)

检验医师

PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学中广泛使用的技术，用于快速复制DNA片段。进行PCR实验通常包括以下步骤：


1. 准备实验材料
（1）DNA模板：包含你想要复制的DNA区域。
（2）引物：短的单链DNA片段，用于指导DNA合成的起始位置。
（3）DNA聚合酶：一种酶，用于合成DNA。
（4）四种脱氧核苷酸（dNTPs）：DNA的构建块。
（5）缓冲液：提供适宜的反应环境。
（6）镁离子或其它必需的离子：通常作为DNA聚合酶的辅助因子。
2. 设定反应混合物
将所有材料混合在微量离心管中。混合物的总体积通常在20-50微升之间。


3. PCR程序
（1）将混合物放入PCR机（热循环仪）中，并设定程序。PCR程序通常包括以下阶段：
（2）初次变性：加热至94-98°C，持续几分钟，使DNA双链解开成单链。
（3）循环步骤（通常进行30-40次循环）：
（4）变性阶段：加热至94-98°C，持续20-30秒，使DNA双链解开。
（5）退火阶段：降温至50-65°C，持续20-40秒，允许引物与模板DNA结合。
（6）延伸阶段：加热至72°C，持续1分钟每1千个碱基，以便DNA聚合酶合成新的DNA链。
（7）最后延伸：在72°C下持续5-10分钟，确保所有可用的DNA模板都被复制。
（8）保持阶段：将温度降至4-15°C，直到用户准备取出样品。


4. 验证PCR结果
通常使用凝胶电泳来检查PCR产物。将PCR产物加载到琼脂糖凝胶上，施加电压，然后使用紫外线下的染料（例如乙idium溴化物）来可视化DNA。
注意事项：
（1）消除污染：PCR极其敏感，极少量的DNA污染就可以干扰结果。
（2）优化条件：可能需要调整引物浓度、循环次数、退火温度等，以优化特定的PCR反应。
PCR是一个强大的工具，允许科学家研究极少量的DNA，从而在基因克隆、遗传指纹分析、病原体检测以及其他许多应用中发挥着关键作用。

卡卡

PCR反应体系的组成与反应条件的优化