化学发光是怎么回事？

John

化学发光是怎么回事？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/46639982

大力水手

化学发光成像系统在细胞研究和药物开发领域中扮演着重要的角色。通过利用化学发光技术，科研人员可以观察和分析细胞内特定蛋白质的表达和定位，揭示细胞信号传导路径的细节和细胞功能的变化。本文将介绍化学发光成像系统的工作原理、应用和优势。




化学发光成像系统

化学发光成像系统是一种先进的细胞成像技术，通过使用化学发光底物和特殊的成像设备，能够实现对细胞内蛋白质的高灵敏度检测和定量分析。在细胞培养实验中，研究人员常常使用化学发光成像系统来研究细胞中特定蛋白质的表达水平，以及其在不同条件下的定位和功能变化。
化学发光成像系统的工作原理基于特定底物与蛋白质结合后产生光信号的原理。在实验过程中，细胞被固定并与一系列试剂处理后，特定的一抗和二抗被用来识别和结合目标蛋白质。随后，添加化学发光底物并通过成像设备捕获产生的发光信号，从而实现对目标蛋白质的检测和定量分析。




化学发光成像仪

在实验中，化学发光成像系统的应用广泛。例如，研究人员可以利用该技术研究细胞信号通路中蛋白质的亚细胞定位、相互作用和表达水平的变化。此外，化学发光成像系统还可以用于药物筛选和药效评估，帮助科学家发现新的药物靶点和研究药物的作用机制。
相较于传统的免疫荧光染色技术，化学发光成像系统具有许多优势。首先，由于化学发光信号的稳定性和灵敏度高，可以实现对低表达水平的蛋白质进行快速、准确的检测和定量分析。其次，化学发光成像系统的自动化程度高，能够提高实验效率和数据重复性，有助于减少实验误差和提高实验结果的可靠性。




全自动化学发光图像分析系统

TanonX6 全自动化学发光图像分析系统适用于化学发光检测，使用深度制冷的背照式CCD作为感光芯片，它具有较高灵敏的发光成像系统，可适用于要求高的化学发光与部分活体动植物发光的检测。其使用的背照式CCD技术，具有较高的感光效率，是传统CCD的数倍。CCD采用深度制冷技术，保证达到低暗噪音；使用全金属密封技术，实现真空环境。
全自动化学发光成像仪-天能电泳仪-tanon凝胶成像仪-发光检测仪-实验室设备厂家参数技术规格如下：
◆摄像头: 美国高分辨率低照度数码制冷相机
◆感光芯片: CCD芯片：Sony ICX694
◆冷却方式: 半导体制冷
◆冷却温度: 低于环境温度65℃（绝对温度-40℃，动态实时显示CCD制冷温度）
◆感光效率: CCD芯片光电转换效率：High QE: ≥78%
◆暗电流: <0.001 e-/pixel/sec. @ -35º C
◆读出燥声: 5.5e- RMS at 12 MHz
◆有效像数: 2750×2200
◆像数密度 : 16 bit （0 - 65535色）
◆像数尺寸 : 4.54um×4.54um
◆像素合并: 1×1，2×2，3X3，4×4，5X5
◆分辨率: 605万像素
◆动态范围: ﹥4.0个数量级
◆电动镜头: F/0.95, 高清晰大口径高通透电动镜头，可通过计算机对焦距的电动调整
◆变焦: 标配抽屉式双位载物对焦平台，可兼容拍摄样品厚度0.01mm—10cm
◆照明模式: 透射白光，反射白光
◆激发光源: 透射：LED白光板; 双侧反射：：反射白光灯（冷光）
◆滤光片位置: 无
◆滤光片: 无
◆拍摄面积: 15×15cm
通过结合化学发光技术和化学发光成像系统，科研人员能够更深入地探究细胞内蛋白质的生物学功能和相互作用，为新药研发和生物医学提供重要的科学依据。

大力水手

在免疫检测中，多种多样的标记物已得到广泛应用。为了实现超敏检测，人们开发了多种不同策略，主要包括提高检测信号和降低背景噪声两种途径。在高于背景噪声的情况下检测出分析物的信号并最大限度减少标记物示踪剂的非特异性结合是信号产生的首要要求。目前，在免疫检测中用于产生信号的标记物（又称为示踪剂）主要包括放射性标记物和酶标记物。
放射性标记物
放射性同位素是一种原子的不稳定变体，能够通过粒子和电磁脉冲的形式释放能量，从而自发转变为更稳定的状态。在免疫检测中，放射性标记物与待测分析物结合后，可以通过对放射性测量获得分析物的浓度。最常用的同位素I常被标记在分析物上来制备示踪剂。碘原子的大小与苯环相当，为避免空间位阻效应，其标记位置的选择非常重要。
I标记抗原主要有两种方法：直接标记法、化学偶联法。
大部分蛋白质可以通过I直接取代酪氨酸或组氨酸的芳香环进行标记。该方法将碘化钠、蛋白质和氧化剂混合，碘化物在氧化剂的作用下转化为游离碘或带正电荷的碘自由基，从而进一步取代蛋白质中酪氨酸或组氨酸残基苯环上的氢原子。最常见的氧化剂是氯胺T，它在水溶液中生成次氯酸起氧化作用。该反应可以通过加入还原剂偏亚硫酸氢钠终止。
对于药物或类固醇等没有酪氨酸残基或半抗原的多肽，可以通过采用碘化含有苯酚或咪唑基团的载体并将其与抗原偶联来合成。偶联物的碘化环部分可以通过桥连分子与抗原连接，如果制备免疫原时载体分子-分析物偶联物与制备示踪剂偶联物时采用相同的桥连分子并在相同位点偶联，就可能产生针对桥连分子的抗体，从而使免疫检测的灵敏度下降。为避免这种情况，免疫原和示踪剂使用不同的桥连分子进行偶联，一般而言，用于示踪剂的桥连分子更大。
放射性水平可以使用含有闪烁剂的闪烁计数器进行测量。闪烁剂在电离辐射下可以发出闪光，光电倍增管将来自闪烁剂的闪光信号转换为电脉冲信号，从而实现计数。
酶标记物
相比于放射性标记，酶标记物应用更加广泛。酶可以催化底物产生颜色、荧光或发光化合物从而产生可测量的信号。单分子酶每分钟可转化107个底物分子来增加信号强度，相比于放射性标记物更加灵敏，但易受到干扰物和检测条件变化的影响，而放射性标记物的检测则更稳定。免疫检测中最常用的两种酶是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。
HRP是一种糖基化的血红蛋白，由原卟啉Ⅸ氯化血红素辅基和308个氨基酸组成，包括4个二硫键和2个钙离子，含有大约20%重量百分比的糖链，并具有6个赖氨酸残基可用与偶联同时保持酶活性。HRP是一种氧化还原酶，可在各种氢供体存在的情况下还原过氧化氢，具有较高的催化速率，活性pH范围为4.0~8.0。



图1 HRP晶体结构图

ALP是一种二聚糖蛋白，含有多个可用于偶联的游离氨基，可催化与伯醇、酚和胺连接的磷酸酯水解。免疫检测中使用的ALP来自于牛小肠，且含有锌，其活性会被锌螯合剂、正磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐和尿素抑制。ALP的活性pH范围为9.5~10.5。



图2 ALP晶体结构图

酶可以通过化学偶联技术与抗原或抗体共价连接形成偶联物，这些偶联方法针对蛋白质中不同氨基酸采用具有不同交联特性的同型或异型双官能团交联剂。如通过与氨基反应，HRP和ALP可以使用戊二醛与抗体或抗原偶联，还可以采用高碘酸法通过HRP糖链的残基进行偶联等。
根据底物的不同，酶标记物可以产生颜色、荧光和发光3种不同的信号源。
比色法是利用分光光度计对颜色信号进行检测，通过信号强度并结合校准曲线可以估算出分析物的浓度。比色法的检测受限于分光光度计的检测范围，通常吸光度在0.1~2.0的范围内，这一范围可以满足竞争法的要求，但不能满足夹心法的测量范围。在比色底物检测中，HRP的常用底物包括ABTS、OPD和TMB，且反应都需要过氧化氢的参与。ABTS是一种用途广泛的通用试剂，TNB具有高吸光值、低背景以及不易诱导有机体变异（OPD可能发生）的优点而常被优先选用。ALP的常用底物是对硝基苯磷酸酯，磷酸吲哚可以产生不容的靛蓝染料，常被用于POCT。相同条件下，HRP与底物反应产生的颜色信号比ALP高一个数量级，因此具有比ALP更高的灵敏度。
荧光检测包括检测直接标记的荧光体和检测底物转化的荧光产物两种方式。荧光体或荧光产物能够吸收特定波长的光（激发光）而使分子内的电子转变为激发态，激发态的电子在转变为基态的过程中，能量会在其他光物理、光化学和非辐射过程中损失，最终以较低的能量（较吸收光波长长的波长处，发射光）发出光子。激发光与发射光之间的波长差称为斯托克斯位移，发射光能量占激发光能量的比例被称为量子产率。理想的荧光体或荧光产物具有较大的斯托克斯位移、较高的量子产率。荧光受温度、极性、pH和溶解氧含量的直接影响，在信号产生前，如果清洗效果不佳，可能由于光散射、荧光背景和样品淬灭等原因而产生干扰。4-甲基伞酮磷酸酯通常作为ALP的荧光底物被脱磷酸化形成4-甲基伞酮，这种荧光体产物的入射光波长约为365nm，发射光波长约为448nm。
化学发光不受荧光背景和自身淬灭的影响，灵敏度比荧光免疫检测高几个数量级。化学发光信号来源于发光化合物发出的光子，而不存在荧光检测中的入射光，在完全避光的情况下，理论背景信号最低可为零。ALP可以水解磷酸化的1,2-二氧杂环丁烷，使其形成一个结构不稳定的阴离子中间体，进而分解发光。在过氧化氢存在的条件下，HRP可以使鲁米诺氧化形成酚或萘酚，其发光强度可增强1000倍，极大提升信噪比。

参考文献：doi:10.1016/j.phytochem.2003.10.022
声明：部分图源网络，侵权联删。
更多体外诊断技术干货分享请关注微信公众号“IVD Tech”，赶快加入进来吧！

清风寡欲

开篇提2个问题：
| 国内化学发光是否格局已定？
| 中小型化学发光企业未来怎么办？
综合多方数据，到2021年底，国内化学发光市场约300亿元，占免疫诊断市场约88%。目前，呈现金字塔式竞争格局：4+5+N  。N是多少？文末会为大家揭晓。基于此估算推演，国内化学发光格局如下：（1）外资份额：228亿元，其中，①罗氏诊断105亿元，占35%；②雅培84亿元，占28%；③贝克曼21亿元，占7%；④西门子医疗18亿元，占6%；
（2）国产份额：72亿元，其中，⑤迈瑞18亿元，占6%；⑥新产业16.5亿元，占5.5%；⑦安图15亿元，占5%；⑧迈克6亿元，占2%；⑨亚辉龙6亿元，占2%；其他10.5亿元，占3.5%。（主要为国产企业，因此归入国产份额，这里有很小一部分外资，暂不计）




化学发光发展历程



（↑：现存309家有化学发光业务的IVD企业，国产+外资，基于工商注册成立日期绘制上图。当然这些企业，成立之时未必就开始研发化学发光业务，因此本图仅做历史轮廓描述，仅供参考）
据上图，国内化学发光发展历程，可分三个阶段：

• 第一阶段：1990S~2003年。这一阶段成立企业共57家，平均每年5家。新产业成立于1995年，国产第一家化学发光企业，一直专注于化学发光免疫分析领域的研究，于2008年9月顺利完成中国第一台全自动化学发光仪的注册，并成功推向市场。
  
• 第二阶段：2004~2011年。这一阶段成立企业共71家，平均每年5~10家，产业发展加速。
  
• 第三阶段：2012~2022年。这一阶段成立企业共169家，平均每年10~15家，并在2020年超过30家，这得益于湖南医疗器械宽松的审批政策。
  

化学发光技术流派

写化学发光技术原理的文章，已经非常多了。这里不再啰嗦，放一张简图，方便大家看看。化学发光，分为四类：直接化学发光、酶促化学发光、电化学发光、光激化学发光。黄工认为，技术演变趋势，大多数是朝着操作更简单、成本更低、更智能更自动化的方向。比如，汽车、计算机、手机、相机等等，越简单、使用门槛越低，各方普及推广的意愿也越大，符合各方利益的最大公约数。



玩家大盘点
花了一个多月时间，终于把国内化学发光有效注册证数据，全部整理、清洗好了。到2022年12月31日，国产化学发光注册证共6968张；到2023年4月5日，进口化学发光注册证642张。两者加总，目前国内化学发光注册证，大约7600张，包括仪器、试剂、质控品、校准品等。去年统计的国产注册证，到2023Q1可能有增有减，但数据差异不会太大也不影响本文论述。这7600张注册证，登录国家药监局数据库，医疗器械板块，输入“化学发光”整理可得。




（↑：目前国内化学发光有效注册证数据，国产+进口，总计7600条
基于上述数据，梳理出国内市场，化学发光相关企业共309家。这309家企业，包括子公司在内，很多不仅从事化学发光业务，也有IVD其他板块的，但都和化学发光有关，就一并整理了。另外，还对这309家企业，成立时间、所属省区市、母公司（控股公司）、业务包含仪器/试剂、发光体系等重要内容，做了进一步的分析整理，基于此表，可一览全国化学发光版图。



（需要上表的朋友，可加入文末黄工的知识星球，有很多干货资料供下载，有技术群供交流）

来看个全貌。国内309家化学发光企业，湖南52家，占17%；广东48家，占16%；北京33家，占11%；江苏32家，占10%；浙江和上海，均为23家，各占7%；山东17家，占5%；天津12家，占4%；重庆11家，占4%；河南和四川，均为8家，各占3%；福建、湖北、安徽3省均为7家，各占2%；广西和河北各5家，分占2%；江西和陕西各3家，占1%；吉林2家，云南、黑龙江、贵州各1家。这些数据，包含国产、进口，也包括子公司在内。湖南化学发光企业数TOP1，主要是其他省市企业，到长沙、湘潭、常德等地注册了子公司。



这309家发光企业，都用哪种发光体系呢？超过一半的企业，采用酶促（间接）化学发光法，163家，占53%；有1/3的企业，采用直接化学发光法，98家，占32%；电化学发光8家，仅占2%；光激化学发光6家，仅占2%；直接法、酶促法都兼容的，有8家，占3%，主要是化学发光CMDO/OEM企业；另外还有25家，未准确表述自家产品化学发光体系的，黄工查询药监局数据库、企业官方公众号、专利数据库等，均未获取到发光体系有关信息。


对上图进一步分析，目前国内主流发光体系（发光底物+标记物）为：AMPPD+ALP和吖啶酯（AE）。163家采用酶促化学发光的企业，有109家的发光体系为AMPPD+ALP（碱性磷酸酶），占66.87%；98家采用直接化学发光的企业，有92家的发光体系为吖啶酯（AE），占93.88%。


那合并子公司，实质运营的化学发光企业主体（母公司），以及国内化学发光版图是怎样的？以下内容，是本文的核心。我们将会看到，目前国内IVD最大市场份额，化学发光赛道都有哪些实力玩家。


上图，我们能看到，国内化学发光生产企业，主要分布于珠三角、长三角、京津冀一带。具体讲，分布于广东省（深圳、广州），北京市（大兴），浙江省（宁波、杭州），上海市（浦东），江苏省（苏州、南京）等省市。外资4大巨头（罗雅贝西），中国总部注册地在上海。国产5大龙头（迈瑞、新产业、安图、迈克、亚辉龙），分布于深圳、郑州、成都。这9家企业地点连线，在地图上构成了一个菱形。也是国内4大经济增长极。
经合并子公司，保留有50%以上控股权的母公司，国内大约有244家，有化学发光业务。这个数据，包含外资企业。具体看下方8张表格，一览化学发光企业档案。排列顺序：华北-华东-华中-华南-西南-西北，注册证数多少。注册证数，统计时间截止2022/12/31，到今天有增减，请注意！有关化学发光仪器型号，这里就不列举了，感兴趣可以看看，黄工另一篇文章《一文概览：化学发光免疫分析仪》，目前累计阅读量为3.2万+。

















结  语
1、开篇黄工提出，目前国内化学发光格局是“4+5+N”。现在回答大家，N=235。N所占的市场份额约为10.5亿元，占3.5%。那么，平均下来，每家企业的化学发光营收，则约447万元。真实世界，肯定不是平均主义。那有非常多的小企业，营收可想而知了。回到开篇的问题“中小型化学发光企业未来怎么办？”，这个问题，智者见智，欢迎文末留言探讨。
2、把化学发光市场，比作一个系统。有哪些内部、外部因素，影响系统走向？确定性的，如国产替代、化学发光集采？不确定性的，如关键原料和零部件，抗原、抗体、酶、磁珠、微球和光电倍增管PMT的自给程度；或者化学发光技术的迭代，设备研发制造水平的提升，工艺材料的创新和改进，相关疾病谱系和人群的增减，新的疾病标志物被发现和应用，试剂和仪器相关理工医学科基础研究进展，产学研各界协同配合程度，各级医院新设速度和数量，最重要的还是本土相关人才培养是否跟得上产业发展速度，等等。这些，都或多或少影响到化学发光格局的演变态势。
3、化学发光赛道，是否还有投资机会？相关交叉技术应用，能否带来新的增量，诞生新的企业，成为新的投资标的，不好说。如果要寻找投资并购标的，列表在上边，可以基于此进一步研究，相信会有新的重要发现，并将带来新的业务变化。
4、最后啰嗦一点，写几句体会或感想吧。本文从构思到发表，历经一个多月，最费时间的，是注册证的整理、分类，以及上头8张化学发光档案信息的反复核实确认。这里要提一点，有约10%的发光企业，表中发光原理、发光体系，黄工打问号，多个渠道未能确认信息：药监局注册证、官网、产品彩页，都不提及或模棱两可，所以信息收集过程很繁琐、很痛苦。希望相关厂家朋友，以后在产品注册或彩页制作时，补齐一些重要信息。
好的作品或产品，是需要花点心思打磨的。不能贪图求快、人云亦云、模仿照搬，应该有自己的判断和坚持，有自己的原创观点，是实事求是、严谨认真对待。黄工做公众号、写文章、办知识星球，都是力争做出好东西，为大家所用，提供一点有用价值，在看完黄工文章，加入黄工星球或社群，买了黄工资料后，对自身业务有所帮助，这就是我的初衷，也是一直追求的。如果你觉得本文还不错，欢迎分享转发打赏。也欢迎加入黄工的知识星球，或买一套资料，原创不易、创业不易。

继续前进

化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质（发光剂）在化学反应时吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发状态，当电子从激发态回到基态时，以发射光子的形式释放出能量，即化学发光。
国内市场上目前存在微孔板式和磁微粒式两种化学发光设备，其中磁微粒化学发光在灵敏度、单样本检测时间、检测范围以及仪器自动化方面均有较大的优势，主要面向三级及人流量较大的二级医院。板式化学发光作为酶联免疫向化学发光的过渡产品，在高端医院已逐渐被取代，仅依靠其低成本、高通量的优势在体检中心、第三方实验室和基层医疗机构占有部分市场，预计其规模约为10亿元左右。


管式化学发光是免疫诊断的主流技术，根据其标记物的不同可分为三大类，即直接化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。直接化学发光是标记物在碱性/酸性条件下，加强氧化剂，瞬间发光，厂家由10个点做成标准曲线，使用时只需在高低两点定标修正曲线即可，节省试剂，结果稳定、准确。酶促化学发光是由酶催化标记物缓慢发光，由于酶不稳定，每次都需用6-12个点做标准曲线，试剂浪费较大。电化学发光的标记物为化学发光剂三联吡啶钌，能够再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定。


相较于传统免疫技术，化学发光具有自动化程度高、特异性好、精确度高、检测范围广等优势。目前，在大多数三级医院，化学发光已基本取代酶联免疫成为主流，检测范围涵盖肿瘤、传染病、甲功、肾功、优生优育、产筛、内分泌激素等各个方向，能够极大满足临床检测所需。
从各应用领域市场份额上看，化学发光目前主要用于传染病、肿瘤、甲功、激素的检测，这些检测项目占测试总量的75-80%，占市场金额的60%；在国内，这些检测项目能占到市场金额的80%以上。国内厂商新产业、安图生物等在肿瘤、传染病、甲功等份额较大检测项目上都有所涉及，并逐步向外拓展。


行行查，行业研究数据库
行行查，行业研究数据库

大力水手

简单的来说，就是基于抗原抗体结合把几种试剂和被检测物结合成一种复合物，然后加入激发液，复合物会重新分解为基本态，这中间会发光，从而用光电二极管来检测，可以得出定量的结果。