分子生物学实验介绍-PCR篇

会里很

PCR是生物领域中最基础，也是尤为重要的一环
今天给大家讲述一些
PCR应该了解的知识 与 实验出现问题的解决办法
首先给大家详细介绍下其原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）原理：
即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。



介绍了原理，少不了得说其几个重要体系成份：
1.模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA、也可以是细菌、组织样品等。
2.引物（Primer）：确定扩增目的序列打的特异性；确定扩增引物长度。
3.DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的机器。
4.缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。
5.脱氧核苷酸（dNTP）:DNA的基本组成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。
6.Mg、K离子增强剂。

而我们在PCR实际操作过程中会遇到很多不可避免的问题，比如说：PCR产物条带拖尾，有杂带，更严重的是除了marker外，啥条带都看不到。





那我们应该如何有效的避免出现这些问题呢？
首先得找出出现这些问题的原因，才能有效解决问题。
常见的问题有很多种，但绝大部分能总结出以下几点。
问题一：完全没有条带
1.确认试剂是否存在质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。
2.检查模板DNA是否正确或者存在特殊结构，导致模板与引物无法结合。
3.引物或反应温度设计不合理。

问题二：有很多非特异性条带
1.反应体系被污染。
2.引物特异性差。
3.退火温度不合适。

问题三：目的条带弱
1.聚合酶活性过低。
2.循环次数偏低。
3.模板DNA浓度过低。

问题四：PCR产物出现片状拖尾
1.DNA聚合酶过多或酶活性差。
2.dNTP和Mg离子浓度过高。
3.退火温度过低，PCR循环数偏多。
4.模板DNA用量过大或模板DNA不纯。
5.引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特异性扩增。

知道了问题的出现原因，就能有效的针对并改变PCR条件，跑出漂亮的条带了。最后祝大家，PCR每次都能成功扩出目的条带。





原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/449260207