Western Blot 实验步骤操作详解

生物科研实验室

1. 上样：样品加载： 上样量：细胞：10ug，组织：20ug，标记物上样量：2ul。
2. 电泳：分离胶浓度：常见有10%、9%和6%（大分子量选用浓度较低的胶，小分子量则相反）。浓缩胶浓度：5%。
电泳缓冲液配制：将100ml母液加入900ml蒸馏水，再加入1g SDS。
电泳条件：运行浓缩胶条件为80v，40min；运行分离胶条件为120v，50min。3. 转膜：电转液：100ml母液+700ml蒸馏水+200ml甲醇（1）将PVDF膜在100%甲醇中浸泡10秒至15秒。
（2）倒入配置好的转印缓冲液于平底托盘中，将PVDF膜和两张滤纸浸泡至缓冲液中。
（3）依次叠放黑色三明治夹，确认胶与膜贴合无气泡，然后垂直插入缓冲液槽内，确保黑色面对应黑色电极。
（4）接通电源，以150 mA电流进行电转，时间根据蛋白分子量而定。4. 封闭：封闭液配制：将2g奶粉溶解于40ml PBST（5%），封闭时间为2小时。
5. 一抗孵育：根据比例稀释一抗，取出封闭结束的PVDF膜，立即加入稀释后的一抗，在4℃孵育过夜。
6.过夜孵育后  二抗孵育：，用PBS洗三次，每次5分钟，然后进行二抗孵育2小时。
7. 显影：混合化学发光试剂A和B比例1：1进行显影，在凝胶成像扫描仪上曝光，使用Image J软件进行蛋白质分析