8分钟掌握PCR核心原理

大v

生物学可以被划为两个时代：一个没有PCR，一个有PCR。没有PCR（聚合酶链式反应，polymerase chain reaction）技术，就没有现代分子生物学。PCR技术发明者Kary Mullis，在1993年获得化学诺贝尔奖，世界称之为PCR教父。


生物体的基因组存储在DNA分子内部，但是分析这种遗传信息需要大量的DNA。1985年，Kary Mullis发明了一种有效的方法，该方法可在短时间内大量复制少量DNA。通过加热，DNA分子的两条链被分离，并且已添加的DNA构件与每一条链结合。借助酶DNA聚合酶，可以形成新的DNA链，然后可以重复该过程。PCR在医学研究和法医学领域都具有重要意义。


医学研究中PCR是至关重要的，本文将用最少的时间带您掌握核心PCR原理，目的是上一次厕所，掌握一个新知识。
1. PCR是干什么的
PCR全称多聚酶链式反应（polymerase chain reaction），是一种非常强大的技术，可以通过一种非常简单但是高效的方法来复制DNA，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
2. 为什么要复制DNA？
DNA复制是很多研究的基础，例如，当我们对RNA进行测序时，必须先将RNA转化为DNA，并进行大量复制。在对于某个人进行基因组测序时，我们不能对于某个细胞或者单个分子进行测序。测序的基础要求拥有大量的相同的DNA分子拷贝，因此，DNA复制是做生物研究中的基础工具。那么怎么获取这么多拷贝呢？PCR正是一个复印机一般的存在，利用DNA的几个特性，成为批量复制DNA的绝佳方法。
3. PCR原理及步骤
说到原理，我们就要回顾一下DNA结构。


DNA分子两条单链以双螺旋结构结成，DNA两条链拥有自行粘附的特性，A与T配对，C与G配对，DNA粘附特性是PCR的核心原理。同时DNA复制时也是具有方向性的，DNA序列的开始端称为5‘端，末端称为3’端。
在复制时，需要加入一种叫做引物（primers）的东西。可以将引物理解为一个短序列，下图中红色的部分就是引物。引物通常15到20个碱基，可以短一些，也可以长一些。但是必须和我们想合成的DNA片段成互补关系。将引物与DNA链混合时，会自动粘在上面，因为他们是互补的。引物获得可以从公司订购，后续有机会我们也会分享引物设计方法。


PCR过程分三步：变性--退火--延伸，PCR中会对这三步循环播放。


A. 变性
在开始准备变性的过程中，要慢慢加热混合物，加热混合物时，两条链间氢键会融化，DNA两股链会分开，就像上图粉色的部分。如果混合物热的情况下，引物不会和DNA黏在一起，两条DNA链也不会黏在一起。
B. 退火
接下来混合物慢慢的冷却，这时引物会黏在DNA上，因为引物较小，更容易漂浮起来，和DNA结合。温度控制在54摄氏度左右可以保证引物序列和DNA互补配对，而DNA双链不会黏在一起。
C. 延伸
这一步我们需要一个帮助DNA复制的工具，即聚合酶链式反应中的聚合酶（polymerase）。下图中绿色的图形就代表着DNA聚合酶，所到之处万物生，这也是我们身体各个细胞中用来复制DNA的工具。聚合酶的作用方式也非常生猛，直接找到部分单链，部分双链的地方，咬住那里的序列开始进行复制。也就是说聚合酶会先找到引物，开始沿着引物进行缺失的序列填充。如下图中看到的，在一轮填充序列后，引物所在的链条（橙色链）会被补齐。这一步中会加入As, Cs, Gs和Ts这些DNA原材料，这样可以把他们整合到新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。这一步的温度稍微高一些，大概是72摄氏度。最初我们加入的是双链DNA，在一个周期后，我们会获得四条链，两个周期后获得8条链，30个周期后，会获得10亿条DNA链。


4. 记忆要点
A. PCR原材料lists

•     DNA
  
• 引物（Primers）
  
• DNA聚合酶
  
• As, Cs, Gs, Ts
  

B. PCR基本原理
变性，复性，碱基互补配对，半保留复制
C. PCR三部曲

• 变性 94°C
  
• 退火 54°C
  
• 延伸 72°C
  

一生二，二生四，四生万物


扯点远的，2019年8月7日，Kary Mullis因肺炎去世，享年74岁。他这一生也是充满了故事，最后用他的quotes来结束这篇分享。
“Science consistently produces a new crop of miraculous truths and dazzling devices every year.”
希望大家可以快乐科研，有所成就。

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