实时荧光定量PCR（qPCR）实验步骤

临床医师

来源：知乎
qPCR: Quantitative Real-time PCR,中文名是 实时荧光定量PCR。qPCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
TakaRa 试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，SYBRGreenⅠ法。
实验步骤：
一，去除基因组DNA反应：
全波长酶标仪测出RNA浓度（单位ng/ul）;按照以下剂量配制10ul体系

试剂	使用量
5×gDNA Eraser Buffer	2 μl
Buffer 2.0 μl gDNA Eraser	1 ul
Total RNA	1ug/RNA浓度
RNase Free dH2O	Up to10 ul

PCR程序：42℃  2min
                 4℃  ∞
二，反转录反应：
按照以下剂量配制20ul体系：

试剂	使用量
步骤 1 的反应液	10 ul
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1 ul
RT Primer Mi	1 ul
5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）	4 ul
RNase Free dH2O	4 ul
Total	20 ul

PCR程序：37℃  15min
                85℃   5s
                4℃   ∞
三，Real Time PCR
按照以下剂量配制20ul体系：

试剂	使用量
SYBR@ Premix Ex TaqII(2X）	10 ul
F Primer(10uM)	0.8 ul
R Primer(10uM)	0.8 ul
ROX Reference II	0.4 ul
反应2的DNA模板	2 ul
ddH2O	6 ul

四，仪器设置
仪器使用的是荧光定量PCR仪Q6-96，设置界面如下图：



欢迎交流学习~

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/367301290