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来源:知乎
问题1:阳性对照有条带,而样本无结果
原因:①模板含有抑制物,含量低;②Buffer 对样品不合适;③引物设计不当或者发生降解;④反应条件:退火温度太高,延伸时间太短。
对策:①纯化模板或者使用试剂盒提取模板 DNA 或加大模板的用量;②更换 Buffer 或调整浓度;③重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者更换一管新引物;④降低退火温度、延长延伸时间。
问题2:非特异性扩增
原因:①引物特异性差;②模板或引物浓度过高;③酶量过多;④Mg2+浓度偏高。
对策:①重新设计引物或者使用巢式 PCR;②适当降低模板或引物浓度;③适当减少酶量;④降低 Mg2+浓度,或更换 mix。
问题3:GC-rich(正常范围为40-60%,>60%为GC-rich)区域难以扩增
原因:GC-rich 区域需要更高的温度才能打开双链,常规的变性温度下可能解链不完全; 同时由于单链的 G+C 丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹二级结构而使 PCR 引物难以结合到模板上,DNA 聚合酶也难以延伸或延伸停止,结果出现严重的非特异性条带,甚至扩增不出靶基因。
对策:①提高预变性温度或变性时间,使双链完全打开;②TD-PCR(梯度 PCR );③换用热启动酶或 mix;④增加 DMSO 等共溶剂,协助 DNA 变性,降低引物 Tm 值,提高产物扩增特异性。
问题4:产物在凝胶上呈 Smear 状态
原因:①模板不纯;②Buffer不合适;③退火温度偏低;④酶量过多;⑤dNTPs、Mg2+ 浓度偏高。
对策:①纯化模板;②更换 Buffer 或 mix;③适当提高退火温度;④按浓度比例设置酶的添加量;⑤适当降低 dNTPs 和 Mg2+ 浓度;⑥减少反应循环次数。
问题5:空白对照出现目的扩增产物
原因:靶序列或扩增产物的交叉污染。
对策:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用;③各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存。
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