全基因组扩增工具面面观

千姿百态

研究人员一直都有办法扩增少量DNA。之前是PCR，如今，研究人员已转向所谓的全基因组扩增（WGA）。与PCR一样，这种技术利用聚合酶来产生起始DNA模板的多个拷贝。但它们不一定基于热循环，因此不太容易产生扩增偏向。

基因组分析，无论是测序、基因分型、芯片分析、比较基因组杂交，还是其他，需要的DNA往往都比你手头上的多。举个例子，新一代测序的操作通常需要微克级的起始材料，这远远超过了从许多临床或法医样品中所获得的。

当然，研究人员一直都有办法扩增少量DNA。之前是PCR，如今，研究人员已转向所谓的全基因组扩增（WGA）。与PCR一样，这种技术利用聚合酶来产生起始DNA模板的多个拷贝。但它们不一定基于热循环，因此不太容易产生扩增偏向。

如今的全基因组扩增

一些技术是在90年代初期开发的，它们使用随机或部分简并的寡核苷酸在多个位点上起始单链基因组DNA。随后，这些引物-模板复合物经过多轮的PCR，按几何级数扩增DNA。几乎就在同时，研究人员引入另一种技术，首先将特异的引物结合位点与限制性内切酶消化的基因组DNA连接，然后利用PCR扩增。这些方法经过不断改进和组合，沿用至今。

然而，由于PCR是指数级的，它无法带来均一扩增。哈佛大学化学与化学生物学的谢晓亮（Sunney Xie）教授指出：“检测单个基因很好，它非常灵敏。但是如果你要检测基因组内的所有基因，那么序列依赖的偏向会很严重，这意味着一些基因的扩增次数可能是另一些的数十亿倍。”他认为，纠正这一问题的一种方法是深度测序，但那会非常昂贵。

多重置换扩增（MDA）的开发在部分程度上解决了扩增偏向的问题1。这种等温技术使用Phi29聚合酶以及耐受核酸外切酶的随机引物。新生链作为进一步起始的底物，启动新一轮的合成，产生超支化（hyperbranched）的DNA产物。

Phi29聚合酶具有3’ → 5’外切酶校正功能，还具有链置换和连续合成的特性，经常用在MDA试剂盒中。它产生的扩增子通常长于10 kb，且错误率比标准的Taq聚合酶低1000倍。

谢教授认为，MDA实现了比PCR更均一的扩增。因为PCR是指数而不是线性，随着拷贝的不断扩增，不同序列在扩增效率上的任何差异会被放大。“错误将会传播。”

避免偏向

人们在对各种基于PCR和MDA的全基因组扩增方法进行修改，以尽量减少扩增偏向。QIAGEN的REPLI-g® Single Cell Kit就是个例子。试剂盒中包含了REPLI-g sc聚合酶。这是Phi29聚合酶的优化配方，具有强的置换活性，能改善扩增均一性，减少嵌合现象。这些独特的组分，以及标准化的UV处理步骤，能消除任何残留的污染DNA。

Sigma-Aldrich的GenomePlex®全基因组扩增试剂盒利用长的准简并引物，它包含通用的5’接头序列，能够与片段化DNA退火。此引物经过等温延伸，产生3’和5’端带有接头序列的片段。之后再利用通用引物进行有限的PCR扩增。据Sigma-Aldrich公司的全球产品经理Savita Bagga介绍，通过最初使用简并引物，大部分起始偏向被避免。此外，该公司最近还推出了SeqPlex WGA试剂盒，让制备出的产物无缝进入新一代测序流程。

单引物等温扩增（SPIA）技术也是让带有接头序列的简并引物与模板DNA退火，从而开始全基因组扩增的过程。在SPIA中，引物是由嵌合的DNA/RNA组成的，它可延长产生双链DNA，其一端带有DNA/RNA异源双链。RNase H和链置换DNA聚合酶降解异源双链的RNA部分，并暴露了另一个引物的结合位点，用于后续的MDA合成。扩增子本身不作为嵌合DNA/RNA引物的模板，从而避免了指数合成的陷阱。

谢晓亮教授及其同事也提出了另一种方法，避免扩增子成为模板。MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles）技术采用随机引物（包含27个碱基的共同序列）与模板DNA杂交2。在65°C利用链置换聚合酶扩增它们，产生“半扩增子”。随后的扩增循环产生完全的扩增子，它们形成发夹结构，防止自身成为模板。谢教授解释道：“我们只使用原始的模板。”MALBAC试剂盒目前可从亿康基因（Yikon Genomics）订购。

考虑因素

在选择全基因组扩增方法或试剂盒时，起始材料的质量、长度和数量，以及产物的预期长度和浓度，都会有影响。

一些技术使用降解、FFPE或片段化的DNA作为起始材料，利用频繁出现的断裂进行起始或连接。其他技术如MDA，则需要较长片段的完整DNA，并产生较长的产物，这也是某些下游应用所必需的，如Southern blotting或RFLP分析。

同样地，一些操作需要较多的起始DNA。例如，Active Motif的GenoMatrix™全基因组扩增试剂盒至少需要10 ng起始材料。产品经理Kyle Hondorp表示，它可能不适用于单细胞。然而，谢教授及其合作者已应用MALBAC来扩增单个卵母细胞和循环肿瘤细胞，一些公司也提供专为单细胞而设计的试剂盒。

正如Hondorp所言，大家最终的希望是开发出足够灵敏的下游分析技术，让全基因组扩增不再成为必需。在此期间，如果您需要的DNA比手头上的多，那您也有大量的选择来完成这项工作。

（作者：Josh P. Roberts）

参考文献

[1] Dean, F.B., et al., “Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification,” Proc Natl Acad Sci USA, 99:5261-6, 2002. [PubMed ID: 11959976]

[2] Zong, C, et al., “Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell,” Science, 338:1622-6, 2012. [PubMed ID: 23258894]