来源:知乎
PCR实验学习笔记 一、基本概念
1. 总述:DNA克隆-利用重组DNA技术
DNA克隆:将目的基因/DNA片段与基因运载体重组,在宿主细胞中扩增得到大量相同DNA片段的过程。
基本过程:
① 重组DNA分子的构建:目的基因+载体——质粒构建
② 转化:将重组DNA分子转移到宿主细胞——细菌转化
③ 细胞克隆的选择增殖---细胞克隆
④ 分离重组DNA分子 ★Fuctions:大量相同拷贝DNA,DNA文库(基因功能研究—生产蛋白质)和cDNA 二、DNA克隆——利用PCR技术
Concept:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)模拟体内DNA复制条件,应用DNA聚合酶反应,体外程序化地特异性扩增某一DNA片段的技术。PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加 三、Steps
a) 变性:模板 DNA 经加热至 94℃ 左右一定时间后,使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;
b) 退火 (复性):模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55℃ 左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合;(退火温度与什么因素有关?)
c) 延伸:DNA 模板--引物结合物在 Taq 酶(耐高温)的作用下,以 dNTP 为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的半保留复制链,这种新链又可成为下次循环的模板。一般为30个循环。 四、实验步骤
1. 取灭菌的Ep管, 建立10μL反应体系(扩大12倍),离心混匀