【5分钟讲透实验】影响PCR实验结果的因素综述

John

来源：知乎
　　聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR），是用DNA聚合酶在体外对特定的DNA片段进行快速扩增的方法。
　　该方法特异性高、敏感性强、操作简单、快速，不通过活细胞，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增10~109倍，现已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。

　　——操作人员
　　PCR技术是成熟的诊断技术，无论是PCR特异性还是PCR扩增效率都是很成熟的。应该认真对待每一步操作、每个小细节，因为该方法与以往的其他检测项目相比，有许多特殊的地方。
　　如敏感性很高，要注意操作和试剂污染问题；整个反应微量，要求操作很精细，取样量很少，吸头多沾一点可能改变整个反应体系成分比例，从而影响PCR扩增的准确性。
　　根据检测经验，PCR检测需要一点点熟练和领悟，需要技术人员有一个操作技术的稳定过程。
　　对于PCR检测中出现的问题，首先应寻找操作人员的自身原因。

　　——PCR技术操作的影响因素及注意事项
　　PCR只需几个DNA分子做模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被少量DNA模板污染和交叉污染，这是造成假阳性最大的可能。
　　1. 使用PCR室前认真洗净手，操作应戴手套并勤于更换。
　　2. 成套试剂，小量分装，专一保存，防止他用。配制试剂用新器具，用后做一次性处理。
　　3. 使用完后切记开紫外15~30min，尤其是配液室；试验完毕要收拾台面，这一点对PCR试验来说尤其重要，因为试验垃圾可能是其他人的污染源，即使不是，未弃的垃圾易成为空气中可能存在的DNA气溶胶的载体，而造成污染。
　　4. 试剂管用前先瞬时离心(10s)，使液体沉于管底，减少污染手套与加样器的机会。
　　5. 加入模板切忌喷雾污染，在吸取液体时，尽量避免用力过快吸取。避免反应成分或模板喷到移液器上，污染移液器和环境。所有非即用管都应盖严，加模板DNA后应更换手套。
　　6. 准确吸取各反应成分，配反应液时要尽量避免1~2μl量加入，避免配单个20μl反应体系。浓度高的液体在应用之前稀释至适当浓度，然后再加入反应体系中。做多管PCR反应时首先将除模板之外的其他成分混合一起,然后再分成单个PCR反应管中，这样，加入各成分的量比较准确。
　　7. 电泳时注意事项电泳上样时，避免PCR产物漂移到其他孔而影响结果判定。特别要注意EB为强致癌物质，必须戴手套，谨慎操作，摇动时不要外溅。

　　——常见问题及解决方法
　　1. 阴性对照和阳性对照都出现阳性扩增带
　　原因：
　　①阴性样品和PCR反应试验污染。
　　②电泳上样时避免PCR产物漂移到其他孔而影响结果判定。
　　解决方法：
　　①更换全部试剂，必要时更换所有移液器。
　　②应小心操作，或琼脂糖凝胶加厚，增加每孔的容量，可避免加样液的溢出。
　　2. 阳性对照呈阴性
　　原因：
　　①阳性样品或加入阳性模板失效。无论是组织还是血清，冻融1次后病原数量明显减少。
　　②加入试剂量不准确或遗忘了某一成分。
　　解决方法：
　　①将阳性对照样品分成小包装。每个包装够用1次最好。
　　②仔细核对试验记录，校对移液器。
　　3. 阳性对照扩增带弱
　　原因：
　　电泳时琼脂糖中核酸染料含量少或长时间后再用已失效。
　　扩增效率不高的原因有：
　　①反应体系问题，操作中加入缓冲液、TaqDNA聚合酶、引物等不准确，造成不能达到最佳反应体系。
　　②仪器不能正常工作。
　　③样品处理过程中残留有较多PCR反应抑制物造成的。总之，多数情况是由于操作者怕PCR不出阳性，有意无意提高PCR检测样品量造成的。
　　对策
　　①是将琼脂糖凝胶放入含有EB电泳液中再染30min后再观察。
　　②检测仪器是否正常工作。
　　③增加纯化DNA或cDNA样品的稀释倍数。
　　4. 出现非特异扩增带（除了阳性带之外样品出现了许多扩增带）
　　原因：
　　①样品模板量过多。
　　②引物或TaqDNA聚合酶多。
　　③Mg2+浓度过高或退火温度过低。
　　对策依据具体实验的情况，分析上述可能出现的原因，采取相应的措施。
　　5.避免假阳性及污染可采取以下措施
　　5.1分室（ 区） 操作：样本处理包括取样、核酸提取与准备试剂
　　PCR 反应及产物鉴定均应分室（ 区） 及分人操作，这是由于污染可能通过样品中经常发生的雾化，如煮沸、震荡、离心等，雾化的颗粒直径可达20μm，体积超这样大小的微粒可含4000个拷贝的扩增产物，因此就尽量在通风厨内内操作。
　　防止污染的最重要的措施是 PCR 准备过程要与同 PCR 扩增产物有关的任何操作完全分开，避免扩增产物与反应物品相接触。
　　5.2设对照：每次 PCR 反应均应设阴性和阳性对照。
　　阴性对照要包括无 DNA 的重蒸水及已知阴性对照 DNA 对照；阳性对照是判断结果的简易方法。尤其是开始做某种 PCR或建立方法时，但阳性对照的扩增产物可能成为以后实验中引起假阳性的根源。
　　因此，目前认为一旦方法成熟就不在设阳性对象，可以从扩增片段的大小或 southern 杂交法判定结果，检测外源 DNA 如微生物 DNA，可用有关的 DNA 克隆片段或基因组做阳性对照。
　　若无，可用书籍阳性的标本代替。
　　5.3其它操作：
　　PCR 扩增和样本处理最好有不同操作者进行，操作人员应戴手套、帽子，并尽量戴口罩、穿隔离衣。
　　试剂操作应尽量减少，对二次扩增即 PCR 的操作要特别严格。作为检测用时，循环次数尽量减少。
　　涉及到 PCR 的离心管、TIP头尽可能一次性使用，开启离心管、加样、取样时要轻柔，避免加样器头部污染，PCR 有关试剂都要装成小管，使用时尽量不要反复多次，一旦有污染的证据即要丢弃。
　　6. 假阴性可采取以下措施
　　6.1 阴性不同于扩增失败，扩增失败有多种原因：
　　主要技术性的如引物、酶、缓冲液、dntps 是否加入，各成份是否失败，反应体积是否准确，DNA 是否变性，解链是否充分等。
　　有二种情况扩增反应可能记为阴性结果，即假阴性，其一是检测某种外源特异 DNA 顺序，如病毒、细菌、支原体等。
　　微生物是否存在基因缺失时，其反应失败误会错误的提示存在缺失。其二，用3｀端错配等位基因特异引物分析单个碱基突变性，扩增失败可能提示引物不能完全与模板退火，并根据失败可能提示引物不能完全与模板退火，并根据失败的反应是用突变引物还是正常引物，把杂合子误为纯合子或正常基因。
　　6.2 避免假阴性可用另一对引物扩增基因组中其它区域的不同长度的 DNA 作为对照。
　　PCR 反应结束后，测量对照DNA 条带大小可表明扩增是否成功，这也不能排除技术性原因导致的失败。
　　假设阴性对照可验证引物，但又增加了污染的可能性，引物对照也增加了 PCR 的费用及反应准备时间，在实际应用中可酌情考虑。
　　当然，对某些阴性结果有怀疑时，也可重复一次 PCR，包括样本处理步骤。
　　PCR 反应具有较大扩增能力与极高的灵敏性的特点，但极容易污染，造成假阳性和假阴性。
　　要时刻注意污染的监测，考虑有无污染，是什么造成的污染，便采取措施，防止和消除污染，保证结果的正确性。

　　实时荧光PCR在实际操作中一定要严格按照标准操作程序进行操作，尽量消除影响检测结果的因素，确保检测结果的准确性。

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