如何看待胶体金法出现假阳性？

会里很

来源：知乎

我最近挺苦恼的，一个月里出现了两个拿胶体金法做出两个阳性的丙肝，送去第三方检验机构，查出来是阴性，我知道胶体金法的差异，但是领导说换试剂厂家看看，这个问题的根不是试剂，可能有一部分原因，更多的原因是方法学的原因，还有今天一个事情，患者说3.13日末次月经，4.6做局麻手术例行体检hcg做的血

虎威将军

在研究细胞和细胞器的复杂结构以及研究细胞生物过程时，电子显微镜是必不可少的。胶体金及其各种衍生物一直是生物电子显微镜中应用最广泛的抗原标记物。这些颗粒可以附着在包括抗体、凝集素、超抗原、聚糖、核酸和受体等许多传统的生物探针上。由于大小不同，这些颗粒在电子显微镜下很容易区分，从而允许同时进行多次标记实验。1971年，胶体金作为一种特殊的标记物首次被引入透射电子显微镜（TEM）。然后在1975年，Horisberger和他的同事开发了用于扫描电子显微镜（SEM）的胶体金法，并于1979年用于荧光显微镜。1979年报道了用X射线绘制金粒子图。

在SEM中，胶体金法已被用于标记许多细胞，包括酵母、红细胞、血小板、肝细胞和乳脂球。SEM的一个优点是人们可以观察到相对较大的区域的细节（图 1）。与其他传统的SEM标记不同，金标记是二次电子的良好发射器，这使得观察者能够在没有金属涂层的细胞表面定位金颗粒。目前最方便的金标记物尺寸约为50 nm，不过也发现了小到Au22的颗粒。





图 1 ：SKBR3细胞中HER2纳米免疫金标的预包埋SEM。无论（A）是否与抗HER2纳米体（B, D）或抗HER2抗体曲妥珠单抗（C）一起孵育，SKBR3细胞都被固定。在冷鱼明胶和乙酰化牛血清白蛋白的混合物中进行免疫标记。随后，用二抗和15 nm的蛋白A偶联金颗粒孵育细胞。按照材料和方法中描述的方法，对样品进行临界点干燥和电子显微镜检查。刻度：左图：A：1µm，B， C：0.5µm，D：0.2µm；右面板：A：250 nm，B-D：100 nm。

在TEM中，由于它们对电子的不透明性和它们的特征形状，可以很容易地识别金标记物。此外，粒径的选择取决于所使用的放大倍率和考虑结合位点的位阻不可达性。Au5和 Au20颗粒是最常用于标记病毒、细菌、酵母、植物细胞和各种动物细胞的颗粒（图 2）。





图 2：SKBR3细胞中HER2免疫金标的预包埋纳米体TEM。SKBR3或MDA- MB-231细胞用4%（w/v）甲醛固定，并进行免疫标记处理。作为阴性对照，省略一抗（A）或使用缺乏HER2表达的MDA-MB-231细胞（B）。SKBR3细胞在（C, E）或（D, F）甲醛固定后与抗HER2纳米体11A4（VHH）（C, D）或曲妥珠单抗（mAb）（E, F）孵育。尺度= 500 nm。

免疫电子显微镜是检测和定位细胞和组织中蛋白质的最佳方法之一。这种方法几乎可以应用于每一种单细胞和多细胞生物，通常可以在结构和功能的关联之间提供意想不到的见解。结合金颗粒的一抗的应用允许对细胞上和细胞内的多种抗原进行高分辨率的检测和定位。但免疫电镜的成功应用是由以下因素决定的：1）蛋白质抗原性的保存；2）抗体浸润整个细胞的能力；3）抗原和一抗之间识别的特异性。此外，需要对生物样品进行适当的处理，例如固定，这涉及到适当选择包埋树脂和针对目标分子的特异性抗体。

虽然传统的电子显微镜不能提供关于特定分子的信息，但免疫金标记可以在可见结构与特定的原位定位和分子分布之间建立高分辨率的联系。如此看来，毫无疑问，胶体金颗粒的应用代表了免疫化学方法改进中的一个重大事件。在将胶体金引入免疫细胞化学的过程中，开发了许多方案。一般来说，它们是基于TEM的， 包括在树脂包埋后的免疫标记或在此过程之前的免疫染色。

虽然胶体金在组织化学中有几种用途，但它的主要应用是在细胞化学中使用扫描电镜和透射电镜。这种方法很常见，它依赖于各种各样的大分子，这些大分子可以附着在金颗粒上。此外，金标记物可以快速廉价地制备，同时几乎没有非特异性吸附，并且可以通过各种方法对其进行量化。它们也是多次标记实验的理想选择。最后，通过在电子显微镜下使用胶体金，可以清楚地识别细胞内抗原。
参考文献
1. Horisberger, M. (1981). Colloidal gold as a cytochemical marker in electron microscopy. Gold Bulletin, 14(3), 90-94.https://link.springer.com/article/10.1007/BF03216735
2. De Paul, A. L., Mukdsi, J. H., Petiti, J. P., Gutiérrez, S., Quintar, A. A., Maldonado, C. A., & Torres, A. I. (2012). Immunoelectron microscopy: a reliable tool for the analysis of cellular processes. In Applications of Immunocytochemistry. IntechOpen. https://sc.panda321.com/#google_vignette
3. Horisberger, M., Rosset, J., & Bauer, H. (1975). Colloidal gold granules as markers for cell surface receptors in the scanning electron microscope. Experientia, 31(10), 1147-1149. https://link.springer.com/article/10.1007/BF02326761
4. Kijanka, M., van Donselaar, E. G., Müller, W. H., Dorresteijn, B., Popov-Čeleketić, D., El Khattabi, M., & Post, J. A. (2017). A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of structural biology, 199(1), 1-11.https://doi.org/10.1016/j.jsb.2017.05.008

原文链接：阿拉丁试剂：https://www.aladdin-e.com/zh_cn/faq/technical-articles/application_of_colloidal_gold_in_electron_microscope/

检验医师

抗原
抗原（antigen）：一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物(抗体或抗原受体)在体内外发生特异性结合的物质 。

抗原/半抗原:不能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（产生抗体），但能够与免疫应答产物(抗体或抗原受体)在体外发生特异性结合的小分子抗原。
抗体
抗体（antibody）：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白 。
免疫球蛋白（抗体）：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
血清中主要的抗体： IgG和IgM。


IgG抗体和IgM抗体和疾病的关系



1.单克隆抗体：高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞 。
2.多克隆抗体：由多个B细胞克隆所产生的抗体，可与不同抗原表位结合且免疫球蛋白类别各异。
3.二抗（鼠抗人IgG/IgM抗体、羊抗人IgG/IgM抗体）等：用抗体作为抗原去免疫其他生物所产生的免疫球蛋白（抗体）。

抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：
Ag+Ab→Ag·Ab
抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。
抗原抗体结合最适比例



敏感性
l化学比色法的敏感度为mg/ml水平
l酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml
l免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿
l标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平
l例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
抗原抗体常见反应原理（重中之重）



胶体金技术
胶体金技术是一种常用的标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。
1971年Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用；
20世纪80年代末，金标记被引入膜快速检测中。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatography)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)。

胶体金，一般指金的水溶液，又称金溶胶。
金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。其中分散的金颗粒直径在1-100nm之间。

胶体金的制备
分散法:包括机械分散法、超声波法、电分散法和胶溶法等。
凝聚法:包括物理凝聚法、化学凝聚法（氧化法、水解法和还原法）。
其中应用最多的是化学还原法。

以下标记步骤最为常见

1.用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需 pH。
2.标记10分钟左右。
3.加入保护溶液。
4. 离心、洗涤。
5.将沉淀悬浮于一定体积（1/10）洗涤缓冲液中。
6.标记后的胶体金也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化。
包被

1. 包被检测线（抗原、抗体或二抗）
2. 包被质控线（一抗或二抗）

清风寡欲

本身胶体金就不能作为确证实验来使用呀！hcg怀孕初期10～14天之后才升高 本身就有灰区 这患者来闹有点说不过去呀 你自己例假期来没来不知道嘛

队长是我

胶体金一般是报阴不报阳，检测阴性可以出报告，检测阳性必须经过其他方法学验证。受方法学限制，特异性达到99%就差不多了，意味着100个检测里出一个假阳，这比例比真阳性在人群中的比例都低。
胶体金就是快，标本简单方便，性能确实要打折扣！

感恩由您

假阳性是没法避免的呀，95%的置信区间，抑或者，胶体金的cv在出厂的时候就已经决定了，所以一般都只能初筛，确诊还是要elisa