干货分享 | qRT-PCR实验全流程（上）

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作者：知乎
用核酸清洁剂擦拭移液枪和台面，确保所有试剂、耗材处理彻底，保证无酶环境。
一、细胞中RNA提取
1.1裂解：添加Trizol破坏细胞释放RNA
每5-10x106个细胞1mL trizol，置于冰盒上。
1.2萃取：添加氯仿使混合物分组
按氯仿：trizol=1:5的比例样品中加入氯仿（0.2ml），剧烈振荡15sec，室温放置3-5min
低温离心机12000rpm，离心15min。离心后溶液分层，RNA存在于层中。
1.3沉淀：添加异丙醇，沉淀核酸
取上清于离心管中，加入等体积的异丙醇，轻柔翻转颠倒3-5次混匀，静置10-20min。
低温离心12000rpm，离心10min
1.4洗涤：弃去上清
将离心后上清丢弃，加入75%乙醇，轻摇，洗涤沉淀，4℃9000rpm，离心5min。
1.5溶解：留沉淀风干
弃去上清，风干3-5min。加入25μL无酶水。
RNA质量评价
RNA总量、RNA纯度、RNA完整性
浓度：
RNA样品浓度=A260x40稀释倍数
RNA浓度＜200ng/μL不适合进行后续实验
纯度：
OD260/OD280=1.9~2.1，代表高纯度的RNA
OD260/OD280＜1.9，有蛋白质残留
OD260/OD280＞2.1，RNA有部分降解
将RNA样品添加至溶液槽中，紫外分光光度计检测 260nm和280nm波长处的吸光值，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
好啦，由于篇幅原因，今天就先讲到这里啦！明天我们继续学习！
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