普通PCR实验

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1 实验器材及试剂
1.1实验器材及耗材

名称

三维冷冻研磨仪

24孔适配器（三维冷冻研磨仪专用）

研磨珠（氧化锆）

涡旋混匀仪

掌上离心机

金属浴

离心管1.5mL（无酶）

PCR反应管（平盖，无酶）

盒装滤芯吸头 10μL（无菌无酶）

盒装滤芯吸头 100μL（无菌无酶）

盒装滤芯吸头 200μL（无菌无酶）

盒装滤芯吸头 1mL（无菌无酶）

移液器

电泳梳子

电泳仪上盖（含电泳导线）

水平电泳仪盒体（含铂金丝）

蓝光灯

水平电泳制胶器

一体式水平电泳仪

PCR仪

超净工作台

台式高速冷冻型微量离心机

凝胶成像系统

超微量分光光度计

1.2主要实验试剂
2 实验步骤
2.1基因组DNA提取
2.1. 1处理材料
a) 取50-100 µL无核红细胞全血（含抗凝剂），置于1.5 mL离心管中，补加溶液Buffer GA至200 µL，使用涡旋振荡器涡旋混匀，接着进行第3步（注意：如果处理更大体积血液，在样品中加入3倍体积红细胞裂解液颠倒混匀，室温放置5 min，期间再颠倒混匀几次，1，000 rpm离心5 min，使用移液器轻轻吸弃上清，留下白细胞沉淀，加入200 µL溶液Buffer GA，使用涡旋振荡器涡旋混匀，接着进行第3步）；
b) 取5-20 µL有核红细胞全血（含抗凝剂），置于1.5 mL离心管中，补加溶液Buffer GA至200 µL，使用涡旋振荡器涡旋混匀，接着进行第3步；
c) 取106-107细胞悬液，置于1.5 mL离心管中，1，000 rpm离心5 min，使用移液器轻轻吸弃上清；
d) 取2-30 mg的动物组织（切勿使用超过最大起始量的组织），置于1.5 mL离心管中，用剪刀尽可能地剪成碎块，对于一些质地坚硬的组织也可以使用研磨仪进行研磨；
2.1.2. 向离心管中加入200 µL溶液Buffer GA，使用涡旋振荡器重悬样品；
2.1.3. 向离心管中加入20 µL溶液Proteinase K Stock Solution，56℃孵育30-60 min（每10 min涡旋混匀），较难裂解的材料可以适当延长裂解时间（注意：如果有未彻底裂解的样品，会导致提取量和纯度偏低）；
2.1.4. 向离心管中加入200 µL溶液Buffer GB，充分上下颠倒混匀6-8次，70℃放置10 min，溶液应变清亮（注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯）；
2.1.5. 向离心管中加入200 µL无水乙醇，涡旋振荡混匀15 sec，若是溶液中有沉淀，则10，000 g离心5 min，收集的上清液转移至新的离心管中，注意尽量不要吸取沉淀；若是没有沉淀，则直接进行下一步；
2.1.6. 如果需要去除RNA，可选步骤a）或b）
a) 向离心管中加入50µL RNase A，吹打均匀后常温放置5 min；
b) 第12步结束后的洗脱产物，向离心管中加入1µL RNase A，吹打均匀后常温或37℃放置5-30 min即可；
2.1.7. 将吸附柱（Bind DNA Mini Columns）置入收集管（Collection Tubes）中，向吸附柱中加入上一步所得产物，10，000 g离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
2.1.8. 向吸附柱中加入500 µL溶液Buffer PD，10，000 g离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
2.1.9. 向吸附柱中加入600 µL溶液Buffer PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），10，000 g离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中（注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如酶切或PCR等，建议Buffer PW加入后静置2-5 min再离心）；
2.1.10. 重复操作步骤9；
2.1.11. 将吸附柱放入收集管中，10，000 g离心2 min，尽量除去残留的液体；将吸附柱置于室温放置5 min或者37℃培养箱放置3 min，彻底晾干（注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶切、PCR等实验）；
2.1.12. 将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附中的膜中间位置悬空滴加50-100µL溶液Elution Buffer或ddH2O（60-65℃预热Elution Buffer或ddH2O后再使用效果更佳），室温放置2 min，10，000 g离心2 min，收集DNA溶液（注意：洗脱液的体积不应少于50 µL，体积过少会影响回收的效率。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2 min，10，000 g离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。洗脱液的pH值对于洗脱效率有较大影响，其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解）。
2.1.13. DNA浓度测定
用Nanodrop 2000检测DNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测DNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
2.2 PCR扩增
2.2.1 PCR体系：

2 x Fast Pfus PCR Master Mix	25 µL
Forward Primer (10 μM)	1.5 µL
Reverse Primer (10 μM)	1.5 µL
DNA	2.0 µL
Water Nuclease-Free	Add to 50 µL

2.2.2 PCR扩增程序设定
预变性   98℃，2min
变性      98℃，20s  ←┐
退火      55℃，20s    │30×循环
延伸      72℃，10s  ─┘
末段延伸     72℃，5min
降温      16℃，2min
2.3琼脂糖凝胶电泳
2.3.1配制 3%琼脂糖凝胶液：称取1.5 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50 mL 1×TAE，微波炉加热煮沸至全部融化，摇匀。
2.3.2制备点样凝胶块：将制胶槽洗干净，晾干，放入制胶器，在固定位置插好电泳梳子。将制胶器置于水平位置，倒入冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液，胶液缓慢展开，直到整个胶槽内铺成均匀胶层，室温下静置直至完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及胶槽放入电泳槽中，添加 1×TAE电泳缓冲液至没过凝胶表面为止。
2.3.3加样：在点样板中按照6：1的比例混匀DNA样品和6×Loading Buffer。用10 ul移液器分别将样品按顺序加入对应的孔中。每加完一个样品，更换一个吸头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
2.3.4电泳：设定电压60-100V，时间30-45min。（注：样品应由负极(黑色)向正极(红色)方向移动）当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
2.3.5观察照相：在紫外灯下观察，采用凝胶成像系统拍照保存。
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