划痕实验（细胞迁移）的实验流程及经验分享

生物科研实验室

细胞迁移(Cell migration)：因其类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验(Wound healing assay)，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。可用于可以观察药物、基因等外源因素对细胞迁移、修复和相互作用的影响。基本原理：在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合，于细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过测量不同时间点的划痕间距并计算差值，可对细胞的迁移能力做出判断。
 实验前准备：
1.学习：了解实验的目的、实验所用试剂耗材、实验基本操作和注意事项、结果分析等。2.耗材：六孔板、马克笔、直尺、200ul枪头、PBS、完全培养基等。3.规划：根据所用细胞生长速度和所需定点拍照时间提前规划实验。建议在做实验之前进行一次预实验。
实验步骤：   1.划线：于六孔板底面，马克笔顺直尺画三条横线作为标记线。2.种板：根据分组种板，细胞密度为5x105个/孔左右。并务必铺匀。3.划痕：待细胞长满后，用直尺比着，200ul枪头垂直于孔板和画的标记线划两条垂线，使划痕与标记线相交，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点。4.清洗：弃去旧培养基，用PBS轻轻润洗两到三次，直到划下来的细胞冲洗干净。5.加液：根据分组分别加入加药培养基或无血清培养基。6.拍照观察：划痕、清洗、加液完成后，用显微镜拍不同倍数的照片，作为0h对照。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。在所需时间点取出细胞，于显微镜下观察同一位置划痕宽度并拍照。7.数据分析：一种是统计细胞迁移的距离，一种是统计划痕面积。都可以用ImageJ软件来进行分析。注意事项或经验分享：1.直尺和马克笔等工具用前务必照紫外消杀。2.种板所用细胞数目可根据细胞的生长快慢调整接种数量。保证每组细胞铺板密度一致，保证每孔务必铺匀。3.提前用马克笔画好线，避免细胞种板后不好操作。枪头画线之前，不要弃去原培养基，否则划下来的细胞团块会堆积在划痕边缘上堆积导至宽度不统一。
4.用枪头画线时，要用力均匀一致，垂直稳定一气呵成，避免宽度差别较大不利于结果分析的准确性。5.根据交叉点定位拍照，避免了前后观察时位置不固定的问题，结果更有说服力。6.务必清洗干净划下来的活细胞，避免在拍照期间细胞贴壁在划痕处并进行增殖影响结果。7.0h拍照时可以在试验记录本上标记拍照位置，以便下各时间段拍摄同一位置。8.拍照时注意不要露出马克笔画的线条，不要镜头过于模糊，尽量不要选择边缘的光影差别过大的位置，切换镜头时不要忘记换标尺，否则都会影响结果的自动分析。
9.根据细胞种类，选择无血清或低血清培养基来降低细胞增殖的影响，或用丝裂霉素（1μg/ml）处理1h，抑制细胞的分裂，消除增殖的影响。但同时也会影响细胞迁移的速度。10.一般拍照时间为0，2，4，6，8，10，12，16，24小时等选取，不建议超过24h，过度增殖造成实验假阳性结果。11.手工划痕可能难以保证宽度一致性，culture Insert是现在市面上也推出的一种可以提前占据划痕区域的模具，将细胞接种于Dish中间的Insert培养，细胞长满Insert区域后用镊子移除Insert产生笔直且无细胞损伤的划痕。