没人会告诉你的qPCR小技巧

生物科研实验室

在进行qPCR实验后，所得到的数据是否可靠，是一个值得关注的问题。如果数据不可靠，就算趋势符合预期，也不应当使用。
如何判断qPCR数据是否可用
第一步：Ct值的评估
Ct值是判断qPCR数据质量的关键指标。以下是Ct值的一般标准：
• 优秀：内参基因的Ct值在14-18之间，目的基因在14-18之间。
• 良好：内参基因的Ct值在12-20之间，目的基因在14-32之间。
• 勉强可用：内参基因的Ct值在10-22之间，目的基因在14-35之间。
如果目的基因的Ct值超过了35，虽然数据仍然可以使用，但可能会对实验结果的准确性产生影响，结果可能偏差很大。因此，如果Ct值偏高，建议重新进行实验。
第二步：溶解曲线的检查
Ct值之后，我们需要仔细检查溶解曲线：
1. 熔点(TM)：应在75-90°C之间。
2. 峰型：应为单峰，无杂峰。
3. 峰距：理想情况下，峰距应在5个Tm单位内。
第三步：扩增曲线的观察
虽然扩增曲线可能不是大家经常关注的点，但它同样重要：
1. 平台期：曲线应有清晰的平台期。
2. 荧光强度(Fluorescence)：至少应在3以上。
3. 二次抬头：曲线不应出现二次上升。
在大多数情况下，只要前两个依据（Ct值和溶解曲线）没有问题，你们就可以大胆地进入下一步进行数据分析。但为了确保数据的准确性和可靠性，建议在完成qPCR后，也留意一下扩增曲线。