一文读懂qPCR探针类型

生物科研实验室

qPCR(实时荧光定量PCR)是在传统PCR基础上加入荧光信号，实时PCR扩增进行检测。它不仅继承了传统PCR高灵敏度和操作简便的特点，而且实现了对样本的定量检测，重要的是，qPCR降低了系统的检测最低限，使其比普通PCR的灵敏度高出1-2个数量级。
根据信号基团的不同，qPCR可以分为染料法和探针法。探针法利用荧光探针实时监测PCR反应过程中的DNA合成情况，定量检测样品中的目标序列，可以很好地解决染料法中存在的非特异性问题。
当下，有多种类型的探针可用于qPCR，不同的探针通过使用不同的荧光基团能发出不同波长的荧光。常见的探针包括TaqMan探针、双杂交探针、分子信标、MGB探针、蝎形探针、双淬灭探针和LNA探针等
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TaqMan探针
TaqMan探针是一种双标记的水解探针，包括一个序列特定的寡核苷酸、5’端标记荧光基团(如FAM、HEX)，3’端标记荧光淬灭基团(如TAMRA、BHQ)。探针完整时，淬灭基团会抑制荧光信号。在目标扩增过程中，Taq酶会裂解结合目标序列的探针，从而使得荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光信号。
TaqMan探针因为其特异性好、结果可靠、成本低廉，成为qPCR中，最常用的探针类型。
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双杂交探针
与TaqMan探针不同，双杂交探针的供体基团和受体基团分别在两个探针上，两个探针都可以与扩增产物杂交，杂交位置不同但非常接近。反应过程中，两个探针在扩增产物上杂交探针荧光，一头一尾。杂交后两组距离在10 nm以内(一般为1-5个碱基)。这时受体基团会发出荧光。
由于两个不同的探针必须杂交到正确的靶序列时，才能检测到荧光。因此，该方法的特异性较TaqMan探针更强。
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分子信标
分子信标是在TaqMan探针的基础上改良的。在TaqMan探针寡核苷酸与基团的连接处，各增加了5-6个互补碱基，形成一个发卡结构，使荧光基团与淬灭基团靠近并淬灭荧光信号。当探针与目标序列结合时，发卡结构打开，荧光基团与淬灭基团远离，从而产生荧光信号。
相比较于普通探针，分子信标特异性更强，能够准确区分靶标序列，检测单碱基突变，是遗传筛选、SNP检测和药物遗传学应用的诊断测定的理想探针
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MGB探针

MGB(小凹槽结合剂)探针和TaqMan探针一样，在两端有荧光基团和淬灭基团。不同的是，在淬灭基团附近有一个MGB，在探针未结合目标序列的情况下，MGB探针随机地盘绕，使荧光基团接近。探针结合目标序列时，MGB帮助探针线性化，荧光基团发光。
MGB的结合一方面可以很大程度上提高探针的Tm值，增加杂交反应的特异性，另一方面能够消除传统淬灭探针产生的荧光背景，提高信噪比，从而提高检测灵敏度。这些特性决定了MGB探针非常适合单碱基突变的检测(SNP分型)。
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蝎形探针
蝎形探针的探针部分与分子信标探针相似，也是5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团，并且形成发卡结构。与之不同的是，蝎形探针带有一段与引物结合位点下游和扩增子内区域相匹配的序列，并且其3’端通过PCR blocker(一个非扩增的单体，防止探针退火后延伸)与PCR引物相连。反应变性阶段发卡结构打开，退火时引物与模板结合并延伸，发卡区与新合成的目的基因的互补区域结合。PCR得到的产物和蝎形探针是一个分子，探针的杂交是在分子内，没有两个分子的参与，从而使杂交反应更迅速有效。
蝎形探针适用多种核酸检测领域。如基因突变检测、病毒RNA/DNA检测和细胞诊断等。
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双淬灭探针
双淬灭探针与普通探针基本工作原理一致，主要区别是在探针内部额外添加第二个淬灭基团。随着探针长度的增加，单淬灭探针的淬灭效果逐渐变差，双淬灭探针应运而生。传统探针的荧光基团与淬灭基团之间有大约 20~30 个碱基，而内置ZEN淬灭基团将这一距离缩短到了只有 9 个碱基。距离缩短能使淬灭更彻底、本底更低，特别是在与传统的 3′ 端淬灭基团相结合时，同时能够在富含 AT 的目标区域使用更长的探针进行设计。除了显著降低本底外，与传统探针相比，双淬灭探针还能提供更低的 Ct 值和更高的精准度。
ZEN 双淬灭探针含有一个 5′ 端荧光基团；3′ Iowa Black FQ (IBFQ) 淬灭基团；以及专有的内置 ZEN 淬灭基团。最常用的 5′ 端荧光基团包括 FAM、TET或 HEX。

因此，双淬灭探针适合替换长度大于25 nt的普通探针，或背景信号高的qPCR试验。
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LNA探针
LNA(锁核酸)是一类经过修饰、含有亚甲基桥的修饰核苷酸，能够限制核糖结构的灵活性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架,故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。
在探针序列中加入LNA可以提高探针的特异性，便于使用较短的qPCR探针，适合一些特殊序列。

这些探针类型在qPCR中扮演着不同的角色，选择合适的探针取决于实验设计、靶标的特性以及需要的灵敏度和特异性。在实际操作中，科研人员根据具体的研究需求和PCR反应的特点选择最合适的探针类型。