一文解锁流式细胞分选的所有秘密

生物科研实验室

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析技术。该技术的核心功能是将多种细胞组成的混合物分类计数，并将感兴趣的细胞分选出来。
那么如何实现分类呢?

通过快速测定标记至细胞上的荧光信号或光散射信号来测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等细胞特征，然后以这些特征为依据，将不同性质的细胞分开，提供分类比例，并将感兴趣细胞分选为单一群体的细胞。
前向散射（Forward Scatter）捕捉由细胞直接阻挡激光引起的散射光，主要用于评估细胞的大小。

侧向散射（Side Scatter）捕捉由细胞内部结构如颗粒引起的散射光，用以评估细胞的复杂度或颗粒性。


细胞内的荧光染料吸收激光，会以较长的波长重新发射光，而荧光探测器（FL1, FL2, FL3）则通过二向色镜（Dichroic Mirrors）分隔不同波长的荧光信号，即将特定波长的光反射至一个方向，而让其他波长的光通过，每个荧光探测通道都配备有带通滤镜，仅允许特定波长范围的光通过，从而检测和区分细胞内不同的荧光标记。

以上根据前向散射、侧向散射和荧光特性的综合分析，细胞被流式细胞分选仪物理分离，即选定的细胞通过电荷偏转被导向不同的收集管，其余细胞则作为废料处理。
1、分选流程

(一) 单细胞悬液的制备

目的: 制备单个、活性高且具有完整表面抗原的细胞悬液。

流程:对于悬浮细胞（如外周血），通常只需适当抗凝处理并保持适宜的保存条件。对于固态组织（如肝、肺组织），需要通过机械分离或酶处理来获得单细胞悬液。细胞必须保持良好的活性和完整的抗原表位，以确保后续分析的准确性。



(二) 细胞特征的标记

目的: 通过荧光标记识别和量化细胞的结构和功能特征。

流程:选择适合的荧光染料或荧光标记的抗体，用于特定抗原或细胞成分的标记。荧光染料在特定波长的光激发下，吸收能量后发出较长波长的光（荧光）。如果用荧光素直接标记细胞分子或荧光素标记的抗体去标记细胞抗原，则荧光信号的强度反映了细胞分子或抗原的数量或含量。



(三) 分类计数

目的: 通过分析荧光信号的强度和特性，对细胞进行分类和计数。

流程:标记后的细胞通过流式细胞仪，利用光散射和荧光检测技术分析细胞的多种参数。对其“强弱”“有无”及平均值或中位值分析，提供细胞的分类和计数信息，实现对细胞亚群的分类和功能分析。



(四) 分选收集

目的: 基于分析结果，物理分离并收集特定的“兴趣”细胞群体。

流程:含细胞的液流在流式细胞仪中被震荡成单个液滴，根据细胞的荧光特性对液滴充电。带电的液滴在高电压偏转板的作用下按荧光特性偏转，被分别收集到不同的容器中，未带电的液滴则进入废液容器。

2、具体实验步骤

(一) 样本制备（以外周血为例）

1.抗体孵育：从抗凝血的样品中取适量体积（如100ul）。加入不同的流式抗体，指弹混匀后，在室温下避光孵育15分钟，以确保抗体与细胞表面标记充分结合。

2.溶血处理：10:1稀释裂红液，并向每个管中加入2ml，振荡器混匀后，室温避光静置10分钟，以去除红细胞，以减少背景信号。随后使用300g的力离心5分钟，以沉降剩余的细胞。

3.洗涤：弃去上清，加入500μL 1X PBS洗液重悬。300g离心5分钟，重复洗涤2-3次，去除未结合的抗体和溶血剂。

4.上机前的准备：弃去洗涤后的上清，加入500μl 1X PBS。混匀后过滤，以去除可能的聚集体或大颗粒，准备上机检测。



(二) 仪器准备及操作

1.开机和检查：检查液流路径是否通畅，加足鞘液，清空废液桶。开启总电源、流式细胞仪电源和电脑主机电源。启动控制软件（如Diva），等待仪器与电脑连接。

2.液流启动：在仪器显示“cytometer is connected”后，进行“fluidics startup”流程，激活液流系统，之后点击“Stream”打开液流。

3.质控：使用CST珠子进行仪器性能检测，确保测量准确性。

4.分选前设置：调节液流，使得窗口形成清晰的液流线，锁定最佳断点。使用Accudrop珠子调整“Drop Delay”，以精准控制细胞分选时机。

5.设置分析条件：建立实验文件夹，根据标记的抗原设定FSC-SSC和各荧光参数的散点图。设定分析门和群级联关系，以区分不同细胞群体。

6.确定电压设置：首先上对照管，根据基本细胞群的散射特性调整FSC和SSC电压。确定淋巴细胞的位置，调整荧光参数电压，记录数据。

7.分类计数和分选设置：根据生物标记之间的关系，进行细胞分类计数和设置分选门。在“sort layout”窗口设定收集装置，选择纯度模式。

8.实际分选：将收集管中分别装200μL 1*PBS,放入仪器分选仓下面的收集管架上;点“sort’开始分选，此时“sortlocation field”框中可见所获得的目标细胞数目:收集到足够的目的细胞后，停止分选。

9.细胞纯度检测：利用上样针清洗液和水清洗上样针，直到以水上样时，FSC-SSC散点图中“无点”为止。将分选获得的阳性细胞上样回测，观察细胞分选纯度。

10.离心收集:将收集到的其余细胞离心，300g离心5分钟，倾倒弃去上清，加培养基继续培养，或备用后续实验。