RNA提取中如何避免污染！

生物科研实验室

RNase在核酸代谢中发挥着重要作用，几乎任何一种原核生物与真核生物细胞类型中均可找到RNase。眼泪、唾液、粘液和汗液等体液中分泌这些RNase，通过它们来防御微生物的入侵。RNase也存在于皮肤碎屑中，掉落于实验台的毛发上，或粘附于衣物的宠物毛发内。不过，大多数环境中RNase的首要来源是微生物——即细菌和真菌。在操作过程中，必须消除、检测和抑制RNase。



关于RNase酶



RNase——特别是RNase A家族的成员——是一些微小紧凑的蛋白，它们含有一些半胱氨酸残基能够形成许多分子内二硫键。因此在恢复至室温后，在无变性剂存在的条件下，变性的RNase会重新恢复其天然结构及部分功能。因此，RNase在反复冻融，甚至高压灭菌后仍会保留相当的活性。这些酶类稳定的天然属性使它们对众多的去污染方法具有抵抗性，通常需要强力的化学方法来消除物体表面和溶液中的RNase。



避免RNase酶污染的来源



体液



体液中含有丰富的RNase活性。不戴手套会非常容易造成RNase污染，对关键实验造成影响。在实验过程中佩戴手套，经常更换。一直穿着实验服，避免衣物上的某些颗粒物质掉入样品。避免在气流扰动的环境操作RNA。



枪头与离心管



高质量的耗材一般可视为不含RNase。不过，枪头和离心管容易成为被忽视的RNase污染源。请确保从未开包的枪头盒中取用枪头，离心管也需来自未开包的。只进行高压灭菌操作无法破坏全部RNase活性，因为这些酶类耐受性强，降至室温后又会重新恢复部分活性。必须使用经过无RNase检测并具有相关认证的枪头和离心管。



水与缓冲液



由于RNase无处不在，供水设备的来源及日常维护常导至分子生物学应用中的水和缓冲液成为RNase污染的常见来源。焦碳酸二乙酯（DEPC）处理是灭活水和缓冲液中RNase最常用的方法。不过，包括Tris在内的某些试剂不能使用DEPC进行处理。



DEPC处理是消除水体、缓冲液及其他溶液中RNase污染最为常用的方法。DEPC能够通过修饰RNase及其他蛋白中的-NH、-SH和-OH基团来破坏酶的活性。处理步骤通常包括将溶液与0.1%的DEPC在室温下共同孵育数小时——通常过夜——之后对溶液进行高压处理以去除残余的DEPC。



部分研究人员注意到在对DEPC处理的溶液进行高压灭菌之后，会嗅到一种果味的芳香气味，便担心这可能是未灭活的DEPC。其实这是由于高压灭菌灭活DEPC过程中，产生了少量的乙醇。乙醇可能会与痕量的羧酸相结合，生成挥发性酯类从而散发出此种特殊气味。这并不是DEPC未经完全消除的信号，不会对后续反应造成干扰。



含有伯胺基（如Tris）及一些含有仲胺或叔胺（如HEPES）的试剂不能使用DEPC进行处理。胺基会与DEPC反应并将其吸收，这样就无法实现对RNase的灭活处理了。同时，对试剂中胺基的修饰也会影响其缓冲能力。对于只能进行过滤除菌，而不能耐受高压灭菌的溶液，如MOPS，也就不适合用DEPC来处理，因为高压灭菌是灭活DEPC必不可少的步骤。



内源性RNases



所有的组织样品都含有内源性的RNases。组织取样后若不进行直接处理（如RNA抽提等），常常需要用液氮迅速冷冻，这样可使RNA的降解达到最少。



检测RNase污染



缓冲体系、溶液



查找和确定RNase污染源常常是一项困难且耗时的工作。最为简单但又最昂贵的解决方案是丢弃现有试剂并启用全新批次的RNase-free试剂。另一个可选项是针对疑似污染溶液测试其中的RNase。



RNA样品



RNase进入RNA样本可在多种情况下发生，如RNA分离时（少量RNase在RNA制备过程中引入），或日常取用时（会不可避免地需要重复开关样品管并插入可能被污染的加样枪头）。RNase的污染通常可以从样品RNA的降解看出来。



可于变性琼脂糖凝胶中对总RNA样本（2-5 g）电泳分析，完整的总RNA样本中28S与18S核糖体RNA条带会显示出2：1的信号强度比率。核糖体比值显著低于2:1通常意味着发生了降解。



降解的RNA样品不适于进行Northern分析、RACE方案，或全长cDNA文库的构建。不过，除非样本发生严重降解，反转录实时定量PCR（RT-qPCR）的应用中对于小扩增子的分析一般不会受到影响。带有某种程度降解的RNA样品仍可进行一些其它类型的分析，如二代测序。在某些类型的样品（如福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)样本或储存时间过久的样本）中，RNA降解是不可避免的。
RNA储存



痕量的RNase即会降低RNA的完整度，即使对冰冻储存的液相样本也是如此。短期保存时，可将RNA样本重悬于RNase-Free水（加入0.1 mM EDTA）或TE缓冲液（10mM Tris，1 mM EDTA）并存储于–80°C。



长期保存RNA的最佳方法是对预先分装的样本进行盐/酒精沉淀操作，并将此沉淀溶液保存于–80°C。低温和酒精能够有效抑制所有酶类的活性。比中性pH更低的酸碱度（添加醋酸钠或醋酸铵）也有助于稳定RNA。请注意，在进行任意后续应用前需先离心沉淀RNA并去除该储存液。



低温储存



当观察到RNA的降解情况时，尽管RNase的污染是最为常见的推测，不过RNA分子在二价阳离子存在的加热条件下其实也会发生链的断裂，如在含有Mg2+或Ca2+离子的条件下，在>80°C的温度下作用5分钟RNA发生断裂。因此，如需加热RNA样本，则最好在螯合剂存在的条件下进行有效螯合二价阳离子，并用相对较低的pH值（6.4左右），能够使RNA碱基的水解情况最小化。