文献分享 | IF=14.7，Nature Communications：非肿瘤铁死亡思路看这里~

科研顾问

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]“铁死亡”这个热点真的是老生常谈了，是不是很多小伙伴都觉得它早已过时？其实，越是如此，能发高分越是难能可贵，遇到这种高分思路，咱们越是不能放过！

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]6月份，中山三院杨扬教授团队就从肝缺血/再灌注损伤入手发了一篇Nature communications！研究首次提供了铁死亡在老年肝脏缺血/再灌注损伤中发挥关键作用，抑制铁死亡可以有效减轻老年肝缺血/再灌注损伤。而且，研究结合了临床样本分析、动物模型和体外细胞实验，提供了从分子机制到潜在治疗应用的全面视角。所以，能不能发高分最关键的就是选题新不新，独不独特。时至今日，会一些生信分析技能也是非常重要的，大家应该发现了，大部分的高分文章都是干湿结合的，同样，今天分享的这篇文章也用到了生信分析。所以，对发表高分文章有需求的小伙伴，满足这两点就成功了一大半。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]题目：老年肝脏中FTO缺乏通过上调ACSL4和TFRC加剧缺血/再灌注损伤期间的铁死亡   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]杂志：nature communications

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]影响因子：IF=14.7

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]发表时间：2024年6月

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]研究背景

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]肝缺血/再灌注损伤(HIRI)在肝移植(LT)过程中不可避免地发生，HIRI使患者易出现早期同种异体移植物功能障碍(EAD)和移植后的排斥反应。老年肝脏相对更容易发生IRI，这严重限制了老年肝脏在LT中的利用。因此，迫切需要揭示IRI的潜在分子机制，以促进开发有效减轻老年肝脏IRI的新治疗方法。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]由于老年肝脏更容易发生脂质紊乱和线粒体衰竭，并且随着年龄的增长，铁离子在肝脏中进一步积累，作者推测老年肝脏更容易发生铁死亡。然而，铁死亡在老年人HIRI中的作用尚不清楚，揭示潜在的调节机制对于开发有效的治疗方法来减轻老年人HIRI至关重要。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]该研究中，作者通过临床标本和体内和体外实验评估了铁死亡在老年HIRI中的关键作用。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]研究结果

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]年龄较大的肝脏比年轻的肝脏更容易发生IRI，并表现出更多的铁死亡

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]作者在人类原位肝移植(OLT)队列(n=20)中评估了供体年龄及其与肝损伤的关系。与年轻组（<50岁）相比，老年组（≥50岁）术后第1天(POD1)血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平较高，而从POD1到POD7的血清AST和ALT水平恢复较慢。此外，HE染色和TUNEL染色显示，老年肝脏组织学变化更明显，肝细胞死亡增加。这些结果证明，年龄较大的肝脏确实更容易发生IRI，但潜在的调节机制尚不清楚。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]结合老年肝脏的生理变化和铁死亡的特点，作者推测老年肝脏更容易发生铁死亡。结果显示，在再灌注后的老年肝脏中，ROS的积累明显高于年轻肝脏，ROS是引发铁死亡的重要因素。老年肝脏的脂质过氧化程度高于年轻肝脏。此外，分析了与铁死亡相关的多个关键蛋白，发现在再灌注后的老年肝脏中，抑制铁死亡的NRF2、GPX4和FTH1的表达水平明显降低，而促进铁死亡的分子ACSL4和TFRC则相反过表达。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]体内实验结果证实，年龄较大的肝脏更容易发生IRI，血清AST和ALT水平升高，肝脏结构保存不良，细胞死亡增加。作者还检测了各组小鼠肝组织中铁死亡水平。双氢乙酯(DHE)分析、C11 BODIPY染色、透射电镜(TEM)分析和western blotting分析进一步证明，老年肝脏中铁死亡的发生率高于年轻肝脏。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]抑制铁死亡可显著缓解老年HIRI

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于这些发现，作者试图进一步探讨铁死亡在老年HIRI中的作用。结果显示，铁抑素-1 (Fer-1)可显著缓解老年HIRI，表现为血清AST和ALT水平降低，肝脏结构保存相对较好，细胞死亡减少，并且在IR期间，Fer1可强烈减弱老年肝脏中ROS的积累和脂质过氧化。此外，体外表征的结果证实了铁死亡在老年HIRI中的作用。Calcein-AM/ PI双染色、DHE染色和C11 BODIPY染色显示，用Fer1处理细胞抑制铁死亡可显著改善H/R对老年肝细胞的损伤。综上所述，这些数据表明抑制铁死亡可以强烈减轻老年HIRI。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]m6A去甲基化酶FTO在老年HIRI中下调

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为了进一步确定影响老年HIRI的因素，作者使用液相色谱-质谱法(LC-MS)筛选年轻HIRI和老年HIRI之间差异表达蛋白。主成分分析(PCA)结果显示，幼鼠和老龄鼠的肝脏样本基本可以独立分组，说明各组之间确实存在差异。肝脏中多种蛋白的表达随年龄的变化而变化。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]接下来，根据以下标准从蛋白质谱中筛选出参与老年HIRI调节的关键分子:(1)年轻和老年肝脏组织之间差异表达的蛋白质可能与老年肝脏对IRI易感性增加有关;(2) IR过程中表达改变的蛋白也可能参与了这一过程;(3) IR期间仅在老年肝脏中表达变化的蛋白。最终鉴定出FTO、n-乙酰基转移酶8(NAT8)和肌动蛋白结合LIM蛋白1 (ABLIM1) 3个分子。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]通过western blotting和IHC检测人和小鼠肝组织中FTO和NAT8的表达，结果显示，老年肝脏和衰老肝细胞中FTO水平明显低于年轻，IR后进一步降低。与FTO不同，NAT8的表达不随年龄或IR发生显著变化。因此，最终关注的是FTO，它可能是调节老年HIRI的关键因素。Dot blotting实验显示，与FTO表达水平相比，m6A甲基化水平在HIRI期间上调，并且随着年龄的增长更为明显。总的来说，这些数据表明，FTO的下调可能通过m6A甲基化的调节参与了老年HIRI的调节。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]FTO通过抑制铁死亡改善老年HIRI

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为了阐明FTO对老年HIRI的影响，作者首先在临床上测量了OLT后供肝中FTO水平与血清肝功能之间的相关性。如图4a、b所示，FTO高表达的OLT受者在POD1处血清AST和ALT水平较低，并且在POD1- pod7处AST和ALT水平迅速恢复，这表明FTO可能减轻老年肝脏的IRI。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为了进一步验证铁死亡在FTO缓解HIRI中的作用，将Fer1和FB23-2联合治疗较老的HIRI模型，发现联合治疗组的情况略逊于Fer1组，明显优于FB23-2组，抑制铁死亡可以显著逆转老年HIRI中FTO失活的影响。此外，C11 BODIPY染色、TEM检测和western blotting结果证明，IR期间，Fer-1显著消除了FTO介导的铁死亡调节，这也表明FTO对老年HIRI的缓解主要是通过调节铁死亡来实现的。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在体外实验中，erastin是一种有效的铁死亡激活剂，用于证实铁死亡在FTO介导的老年HIRI缓解中的作用。在H/R过程中，Ferry-1对铁死亡的抑制显著逆转了FTO失活对细胞死亡、细胞内ROS积累和脂质过氧化的影响，这与体内实验结果一致，而用erastin处理则产生相反的结果。这些数据进一步表明，FTO介导的老年HIRI缓解主要是通过调节铁死亡来实现的。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]FTO通过m6A去甲基化抑制ACSL4和TFRC mRNA的稳定性

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为了探索FTO调控铁凋亡的潜在机制，对转染对照质粒或FTO过表达质粒并进行H/R的衰老THLE2细胞进行了甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)。MeRIP-seq在FTO过表达组和对照组之间共发现1689个差异的峰。其中，49.38%的差异丰度峰的m6A修饰水平下调，另有50.62%的差异丰度峰的m6A修饰水平上调。对下调的峰进行了功能富集分析，发现这些峰富集于铁死亡相关通路中。ACSL4和TFRC可诱导铁死亡，被预测为FTO的潜在靶点。过表达FTO显著降低Acsl4的5'UTR和Tfrc的3'UTR的m6A修饰水平。然后，采用MeRIP-qPCR检测Acsl4和Tfrc的m6A修饰的变化。结果显示，FTO过表达可降低Acsl4和Tfrc的m6A水平。为了进一步验证FTO可以靶向Acsl4和Tfrc，作者还进行了FTO-CLIP-seq。Acsl4和Tfrc中FTO富集的区域与FTO过表达后m6A修饰水平显著降低的区域重叠，这进一步表明FTO可以结合Acsl4和Tfrc降低两者的m6A修饰。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]接下来，通过RT-qPCR和western blotting检测FTO介导的m6A修饰是否会影响ACSL4和TFRC的表达，结果显示，过表达FTO会抑制ACSL4和TFRC的表达，而沉默FTO或抑制其去甲基化酶活性则会显著逆转这种影响。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于m6A修饰对mRNA稳定性和衰变的调节作用，作者检测了与放线菌素d共培养后Acsl4和Tfrc mRNA的半衰期。观察到，FTO的过表达导至Acsl4和Tfrc mRNA半衰期缩短。最终发现，FTO可以通过去除转录后m6A修饰缩短Acsl4和Tfrc mRNA的半衰期，最终降低Acsl4和Tfrc的表达。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]FTO通过铁死亡介导的老年HIRI缓解以ACSL4和TFRC依赖的方式发生

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为了探讨ACSL4和TFRC在FTO介导的老年HIRI缓解中的作用，作者通过尾静脉注射嗜肝腺相关病毒(AAV8)诱导老年小鼠短期和短暂下调ACSL4或TFRC的表达。此外，将FB23-2用于这两种AAV8预处理的模型，结果表明，敲低ACSL4或TFRC不仅能有效缓解老年HIRI，而且能显著逆转FB23-2在这些模型中的作用。这些结果表明，FTO的肝保护潜力取决于其对ACSL4和TFRC的调节。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在体外，衰老肝细胞中ACSL4或TFRC的过表达显著逆转了FTO介导的细胞死亡减少、细胞内ROS积累以及IR期间脂质过氧化。相反，ACSL4或TFRC的下调显著削弱了FTO沉默或FB23-2治疗的效果。这些体内和体外数据表明，FTO以依赖于其对ACSL4和TFRC的调节的方式减轻了老年HIRI。   

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]NMN通过增强FTO的去甲基化酶活性来缓解老年HIRI

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]NMN是NAD+的重要前体之一，已被批准用于抗衰老治疗。在此，作者想知道NMN是否可以作为缓解FTO相关m6A的老年HIRI的有效治疗方法。从血清肝酶水平、H&E染色和TUNEL染色的变化可以看出，NMN治疗显著改善了老年HIRI。此外，m6A点印迹实验显示，在IR期间，NMN显著下调老年肝脏中m6A修饰水平，证实NMN可以增强FTO的去甲基化酶活性。最后，DHE染色、C11 BODIPY染色、western blotting和TEM分析进一步证明了NMN抑制铁死亡的潜力。总的来说，数据显示FTO-ACSL4 /TFRC调控通路有助于老年HIRI的发病机制，NMN可以增加FTO去甲基化酶活性以改善老年HIRI。这些结果可能有助于临床转化，以减轻老年供体的IRI LT患者。   

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]文章小结

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]总之，研究证明通过NMN增强FTO去甲基化酶活性可以通过降低ACSL4和TFRC的表达来缓解老年HIRI，这两种分子都是导至铁死亡的关键分子。需要进行进一步的临床试验来评估NMN对OLT中接受老年肝脏患者肝功能改善的作用。铁死亡不仅可以用在肿瘤方面，如果非肿瘤疾病尤其是一个研究比较少的疾病结合该热点也是一个不小的创新，因而也能发一篇高质量的文章。