荧光定量PCR全流程实验步骤和注意事项

生物科研实验室

1 总述
实时荧光定量PCR（后续简称为qPCR）顾名思义就是在PCR反应体系中加入荧光物质，通过荧光信号的实时接收监测PCR反应进程，由于其模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，以此为依据进而达到定量的目的。
简单来讲，qPCR可分为荧光染料法（以SYBR GreenⅠ最常用）与荧光探针法（TaqMan 探针）两种，而其结果分析方法也有绝对定量和相对定量之分。在此不一一赘述，此次分享以SYBR GreenⅠ法为例，结果分析选用相对定量法。

2 实验设计
2.1 总述——为什么要进行实验设计
实验设计是科学研究中重要一环，好的实验设计在确保实验严谨有序进行的同时也为研究者差缺补漏、原始数据的保存、实验条件的优化等提供了便利，因此，在开始实验前做好实验设计是很有必要的。

2.2 如何做好实验设计
想要做好实验设计，实验前的准备工作是十分关键的，对实验流程越熟悉，逻辑上越成环，实验设计也会越发巧妙和完备，以我个人经验来说，做好实验设计需要从以下几方面入手：
全面充分地了解实验原理，掌握实验背后的底层逻辑；

熟悉实验的规范化操作流程，从一开始就养成规范操作的习惯（注：这点非常重要，有的同学可能做实验的时候马马虎虎，只追求结果，实验做出来了却连规范化的实验怎么做都不清楚，稀里糊涂的，还有可能把别人带“坑”里，查原始数据才发现实验都是错的，瞎折腾）；

尽可能地了解你所用到的实验设备和试剂，当然也要对比别的同学所用耗材，事无巨细，这是我们查找实验问题最关键的一步（注：此步在实验设计阶段尽可能有个大致了解，具体了解基本上是等实验正式开始真正用到了，但最起码得知道要用到什么东西吧）；

养成做好实验记录的好习惯：好记性不如烂笔头，最初实验设计是咋样的，后续进行了怎样的优化等等，越详细越好，任何一个被忽略掉的细节都有可能导至实验失败哦；

好的实验设计关键在于“灵活”，能保证条件随处可调的同时却不打乱实验节奏！

2.3 实操环节——RT-qRCR实验设计（注：此处以最基本的两组（实验组、对照组）三样本为例做一演示，其他增加组别或者增大样本量什么的都是在此基础上的衍生，要活学活用哦！）
背景假设：倘若要用RT-qRCR实验看A、B、C、D四个基因的相对表达量，并以此进行实验设计。

2.3.1 实验前准备：提取三个样本的RNA并逆转录得到三个样本的cDNA。
（注：a. 要确保逆转录得到的cDNA量要满足此次实验的需要，当然别忘了把预实验的用量也包含在内哦；b. 为尽可能消除个体差异带来的影响（组织），可以在提取RNA的时候将组织多混一，如5个组织各取一些混在一管提取RNA作为样本1等）

2.3.2 计算：我们首先要通过预实验看其熔解曲线（用于判断引物特异性）、Ct值（即大致表达情况）、模板的稀释倍数等情况。
注：本人所用qRCR的反应体系如下：
模板（cDNA）：2ul；
上游（下游）引物：0.4ul；
无酶水：7.2ul；
预混液Mix：10ul；
总体积：20ul

4个基因，在不知道稀释倍数如何的情况下可以多设置几个稀释梯度，如：原液、5倍、10倍、20倍等等，当然有经验值是最好不过了，比如我们课题组所做基因基本稀释3倍、5倍基本可以