细胞凋亡的检测方法

生物科研实验室

细胞凋亡的早期形态学改变是核染色质浓聚、固缩,聚集在核膜周边,然后是胞浆浓缩、胞膜起泡,继而细胞核裂解成若干碎片,细胞膜将胞质和染色质断片包裹,胞浆内形成多个膜结构尚完整的“小泡”及 “凋亡小体” (apoptoticbody)。这不同于细胞坏死的细胞肿胀、胞膜破裂、细胞崩解，但凋亡的细胞有固定的特征，因此诞生出细胞凋亡形态学检测方法。
一、光学显微镜观察

凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。

检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。

二、视频时差显微技术

细胞培养中常用，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，持续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织。

检测方法：收集2×10^5细胞/ml培胞，置于多孔培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔1分钟作序列摄影，连续24小时。如同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观察和摄影。
三、电子显微镜观察

虽然光学显微镜下可以看见胞膜起泡现象和凋亡小体,但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构,因此用光镜观察难以令人满意,而透射电镜可清楚地观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法,被认为是确定细胞凋亡的金标准。

检测方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。

四、流式检测

流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性（granu-larity）有关。
细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导至小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡细胞。
根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。
检测方法：获取密度1×10^6细胞/ml左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流式细胞仪分析。
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。通常使用细胞凋亡检测试剂盒，如常见的Annexin V荧光双染法，其检测原理为：Annexin V/ Annexin A5为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙依赖的方式与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。PS存在于正常细胞浆膜的内层，但在凋亡早期，膜不对称性丧失，PS易位至细胞表面。荧光标记的 Annexin V可与之特异性结合，表明该细胞为早期凋亡细胞。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液，碘化丙啶可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。