BCA定量后WB内参不齐，问题出在哪里？

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BCA定量后WB内参不齐可能是由多种因素引起的。以下是一些可能的原因和相应的解决方法！
  BCA定量后WB内参不齐的原因：
1 样品处理不一致：确保所有样品在裂解、超声、离心等步骤中处理方式一致。取上清时也要注意不要吸到沉淀。只有蛋白液浓度均匀，取的2ul进行BCA检测才能代表真实的样品浓度，
2样本PBS洗涤：在使用PBS洗涤细胞时，一定要确保洗涤充分，避免血清中的蛋白质被BCA定量误计，这会导至WB实验中内参条带不齐。
3  上样体积不统一：统一上样体积，便于后期调整。
4 组织蛋白含量差异：组织蛋白含量大时，需要进行BCA测定，因为不同组织间蛋白含量可能存在较大差异。
5 细胞样品：对于细胞样品，保证铺板时各组细胞量差不多，资质实验员可以不需要BCA定量，看离心后收的细胞沉淀大小差不多就可以图片。
6 蛋白保存问题：长期保存的蛋白可能存在降解或沉淀问题，建议重新提取蛋白。反复冻融的样本也会蛋白降解。即使是煮过的蛋白，长期保存在-20℃也会逐渐降解。应尽量使用1个月内的蛋白样品，避免反复冻融。
7 蛋白与loading buffer混合问题：混合后可能存在沉淀，务必上样时避免取到沉淀。还有一个点需要注意，由于loading buffer粘稠，容易在枪头外壁粘附，特别是小体积样品更易出现误差。吸取时应尽量减少枪头浸入液面的深度，避免枪头侧面蹭到管壁。
8 蛋白定量准确性：确保BCA法测定的标准曲线R值接近0.99，以提高定量准确性。
9 内参选择：如果使用tubulin作为内参出现不齐，可以尝试更换其他内参如GAPDH
10  曝光液均匀性：在进行WB曝光时，要确保曝光液充分均匀地淋在条带上，以获得可靠的结果。如果曝光液不均匀或有干燥的地方，条带会显得较淡，影响结果的可信度。