手把手教学｜免疫组化染色实验步骤

生物科研实验室

免疫组织化学技术：检测组织原位表达的肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等抗原性物质。

免疫 immuno- 抗原抗体的免疫反应

组织 histo- 检测组织中表达的抗原性分子

化学 chemistry 酶促/荧光可见反应



（一）组织和细胞标本的准备

1.组织标本的取材 —— 取材新鲜，固定及时，形态完好。

2. 细胞标本的准备

（1）活体细胞标本： 印片法、穿刺吸取法、沉淀法

（2）培养细胞标本：

① 细胞涂片: 将细胞制成悬液（10^6）涂在 涂有切片粘合剂的载玻片上，晾干后固定（细胞甩片）。

②细胞爬片: 将细胞直接培养在盖玻片上 将细胞直接培养在6孔或9孔板上。

3.固定

(1)保持形态：终止和抑制外源性和内源性酶活性，防止 组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，保持组织细胞的固有形态。

(2)保存抗原：使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构和定位与生活时相仿。

（3）硬化作用：固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。

（4）便于观察：使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学差异，以便染色后易于鉴别和观察;经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。


注意事项：

①防止脱片：玻片预处理(多聚赖氨酸)、温和操作。

②力求保持组织新鲜， 勿使其干燥， 尽快固定处理。

③组织块不易过大过厚，必须小于 2cm x 1.5cm x 0.3cm，尤其是组织块厚度须保持在0.3cm 以内。

④固定剂必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍。

⑤组织固定后， 应充分水洗，去除固定剂，以减少固定剂造成的人为假像。



（二）石蜡切片免疫组化染色实验步骤

1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置 60℃ 1 小时）。

（1）二甲苯Ι、II，各 10 分钟。

（2）梯度酒精：100%，2 分钟→ 95%，2 分钟→ 80%，2 分钟→ 70%2 分钟。

（3）蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床）。

2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温 10 分钟（避光）。

3．蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床）。

4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。

附：抗原修复液（10mM pH 6.0 枸橼酸钠缓冲液）的配制：

（1）储备液的配制：

A 液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水 1000ml。

B 液：枸橼酸 21g + 蒸馏水 1000ml。

（2）工作液的配制：A 液 82ml + B 液 18ml + 蒸馏水 900ml。



抗原修复的方法：

（1） 高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0），淹没切片，盖 上锅盖，高

压锅内煮沸，上汽 3 分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。

（2） 微波处理技术:用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档，5 分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档，5 分钟.（最佳温度为92∼95℃）。

（3）酶消化处理：此略。

抗原修复的注意事项：

（1）组织不能干。

（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。

（3）该方法主要用于 10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。

（4）抗原修复后至 DAB 显色的过程中，均需用 PBS 缓冲液。



5．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织

周围的水分（保持组织呈湿润状态），滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体 同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。

附：正常血清配制 (或按试剂盒规定的浓度配制)：按 1:20 比例，用 PBS 配制，每张切片需要量按 50μl+5μl (10%抛洒量)计算。

7．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2 小时

（也可置于 4℃冰箱过夜）。

8．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

9．滴加生物素化的二抗，37℃，40 分钟。

10．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

11．滴加三抗 （SAB 复合物），37℃，40 分钟。

12．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

13．DAB 显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。

附：DAB 的配制：

（1） 储 备 液 (DAB 25mg/ml) 的 配 制 ：DAB 250mg + PBS 10ml ， 待 完 全 溶 解 后 分 装 成1ml，100μl，50μl，20μl 等，-20℃，冻存。

（2）工作液：DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl。

14．自来水（细水）充分冲洗。

15．苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。

16．自来水冲洗返蓝，15 分钟。

17．梯度酒精脱水：80%，2 分钟 → 95%，2 分钟 → 100%，2 次，5 分钟。

18．二甲苯透明：I，III（二甲苯）各 5 分钟

19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。
（三）细胞爬片的免疫组化染色

1. 取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定 20 ∼30 分钟。

2. 蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。

3. 打孔液浸泡 5 分钟。

4. 蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。

5. 后接前述实验步骤的第 6 步（正常血清封闭）。

注：第 3、4 步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。



（四）冰冻切片的免疫组化染色

1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存)，厚度为 5～6μm。

2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。

3. 如不马上染色，可密封后-20℃保存。

4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分钟。

5. PBS 洗 2 次，每次 5 分钟，(必要时应用 0.1%柠檬酸+0.1%triton 打孔)。

6. 3% H2O2 灭活内源性过氧化物酶，20 分钟，避光。

7. 用 PBS 洗 2 次，每次 5 分钟。

8. 接前面实验步骤第六步。



（五）切片的预处理

1. 洗衣粉液浸泡 30 分钟，冲洗，晾干。

2. 洗液 （含强酸、高锰酸钾等）浸泡 24 小时，冲洗，晾干。

3. APES（1:50 丙酮溶液） 10-20 秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。

4. 纯丙酮 I，约 10 秒；纯丙酮 II，约 5 秒。

5. 晾干或烤箱内烤干，备用。