干货分享 | 活性氧 ROS 检测攻略大全！

生物科研实验室

活性氧 (ROS)
【定义】: 活性氧 (Reactive oxygen species, ROS)，细胞正常代谢的副产物，氧的部分还原代谢产物，是源自 O2 且比 O2 本身更活泼的物质的统称[1][2]。
【组成】: ROS 不仅包括超氧自由基阴离子 (O2•−) 和一些其他氧自由基，还包括一些 O2 的非自由基衍生物，如过氧化氢 (H2O2)、次氯酸 (HOCl) 和过氧亚硝酸盐/过氧亚硝酸 (ONOO−/ONOOH)。
【来源】: ROS 主要在线粒体中产生，除细胞代谢外，ROS 还由特定的质膜氧化酶在生长因子和细胞因子的作用下产生，同时也可通过外部因素（如环境应激、辐射、药物等）引起增加。

为什么要测活性氧 (ROS) ？
ROS 具有强氧化能力，低浓度时发挥复杂的信号传导功能，但在高浓度时对细胞有害。
【氧化应激】细胞具有一套防御系统来将 ROS 维持在生理正常水平，即酶促抗氧化剂，负责将自由基转化为稳定的、危害较小的分子。但当细胞产生的 ROS 超过其抗氧化能力时，可能会对细胞大分子（如脂质、蛋白质和 DNA）造成损害，导至氧化应激状态。

这种损伤被认为与许多疾病的发展和老化过程相关，包括肺动脉高压、心肌病、糖尿病、帕金森病和癌症等。
【抗氧化剂】生物学中存在多种抗氧化剂。体内的主要抗氧化剂是酶系统，例如，超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD) 将 O2- 转化为 H2O2、过氧化氢酶作用于 H2O2 产生 H2O 和 O2、谷胱甘肽过氧化物酶分解 H2O2 和 LOOH 等。此外，还有常用作“抗氧化剂”的低分子量化合物如 N-acetylcysteine (NAC)  等。
活性氧 (ROS) 的检测
目前针对 ROS 的检测方法主要有荧光染色法、电子顺磁 (自旋) 共振技术(Electron paramagnetic (spin) resonance, EPR/ESR)、化学发光法、色谱法、分光光度法、电化学生物传感器和基于荧光蛋白等。
特定 ROS 检测方法

ROS：O2•-
检测试剂：HKSOX-1，HKSOX-1r，HKSOX-1m
超氧阴离子自由基 (O2•-) 一直被认为是一种重要的细胞信号分子，参与先天免疫和代谢稳态等多种生理和病理过程。O2•- 的异常产生可导至铁硫 (Fe-S) 蛋白和半胱氨酸硫醇等生物分子的氧化损伤，或直接诱导细菌和哺乳动物细胞死亡。其二次产物，如过氧化氢 (H2O2)、羟基自由基 (OH)、过氧亚硝酸盐 (ONOO-) 和次氯酸(HOCI)，也参与信号转导和多种病理状况。
ROS：H2O2
检测试剂：HKPerox-1，HKPerox-2

H2O2 主要由 NADPH 氧化酶与超氧化物歧化酶、线粒体电子传递链和许多其他酶共同产生，是一种强双电子氧化剂，但其高活化能限制了其对少数生物靶标的反应性。H2O2 相对稳定。它与谷胱甘肽、半胱氨酸和蛋氨酸的反应非常缓慢，但根据特定的蛋白质结构和环境，其对特定蛋白质中半胱氨酸的反应活性可大大提高到 10 M-1S-1 (约为蛋白质中平均半胱氨酸的 106 倍)，为 H2O2 在氧化还原信号中的选择性和特异性提供了基础。它们在细胞信号传导中起作用，特别是在免疫系统中，并通过铁下垂参与细胞死亡。
检测试剂：HKPerox-1，HKPerox-2

在所有活性氧 ROS 中，•OH 被认为是最具活性和最有害的一种。它的寿命很短，大约 10-9 秒，可以与许多生物分子如 DNA 碱基、脂质和蛋白质以扩散控制的速率发生反应，它的过量产生会导至细胞损伤，并与多种疾病有关。另一方面，越来越多的证据表明，“•OH”和其他 ROS 的产生可以应用于癌症治疗。因此，监测细胞内•OH 对于了解其生物学影响和进一步研究其治疗用途至关重要。
ROS：HCLO
检测试剂：HKOCl-3，HKOCl-4，HKOCl-4m

次氯酸和次氯酸盐是细胞内重要的 ROS 之一，它由 H2O2 和 Cl- 通过髓过氧化物酶催化，HOCl 可以作为免疫防御系统破坏侵入性细菌，而另一方面，由于致病性氧化应激损伤，它可以引起包括癌症在内的许多疾病。
ROS：ONOO-
检测试剂：HKYellow-AM (6/12-mixture)、 HKGreen-4I
氧化自由基包括活性氧 (ROS) 和活性氮 (RNS) 在脑 I/R 损伤的病理过程中起着至关重要的作用。在脑缺血再灌注阶段，同时产生的一氧化氮 (NO) 和超氧阴离子(O2•-) 以扩散速率迅速形成过氧亚硝酸盐 (ONOO-)。ONOO- 可以穿透生物膜，甚至具有比 O2•- 更高的扩散能力。ONOO- 通过触发一系列分子级联反应，在介导凋亡细胞死亡、炎症、梗死扩大和血脑屏障破坏中发挥关键作用。