干货分享 | 蛋白定量的3种常用方法

生物科研实验室

蛋白质含量可从它们的物理化学性质，如折射率、比重，紫外吸收、染色等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、 folin-酚试剂反应、BCA法等方法来测定。


一、比色法


蛋白定量常使用的方法是比色法，通常用于总蛋白的定量分析。根据蛋白和比色试剂的结合，可以将比色法分为：蛋白-染料结合法和蛋白-铜螯合化学试剂法。前者对应的典型蛋白定量比色法是考马斯亮蓝G250染料结合法，后者则包括双缩脲法，Lowry法，二喹啉甲酸(BCA)法。



1、Bradford法

Bradford法原理是在酸性溶液中，考马斯亮蓝G250通过与蛋白质中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰位置由488nm变为595nm，颜色从棕红色变为蓝色。结合到蛋白质分子上的染料数与蛋白所带正电荷成正比，通过颜色的强弱即可测定蛋白质浓度的高低，因此可以用该方法来对蛋白进行定量。

因染料主要与蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合，且两者在各种蛋白质含量不同，故用于不同蛋白质测定时有较大偏差，另外范德华力和疏水作用也会影响蛋白与染料的结合。
Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，如：K⁺、Na⁺、Mg²⁺离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP和β-巯基乙醇等。但需要注意的是：由于高浓度洗涤剂会影响检测结果的可靠性，必须确保样品中的SDS的浓度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween20,60,80低于0.06％。

检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质，前者采用考马斯亮蓝G250，后者采用考马斯亮蓝R250；G250和R250分子基本骨架一样，但是G250多了两个甲基，与蛋白反应迅速，染胶慢且脱色困难，故用于蛋白定量；R250与蛋白反应较缓慢，染胶较快且易于洗脱，故用于PAGE胶染色。





2、 BCA法

BCA(bicinchoninic acid，二辛可酸)法测定蛋白的原理：二价铜离子在碱性条件下可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和含有BCA的溶液相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。
该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，并于标准曲线对比，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。
3、双缩脲法

双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜可形成紫色络合物(肽链中的氮原子和铜离子配价结合)，称为双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围1-10mg蛋白质。
双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应，使其有利于对蛋白质纯化早期步骤的测定。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，例如Tris缓冲液，因为它们给予阳性呈色反应。Cu²⁺也容易被还原，有时发现出现红色沉淀。



4、Folin-酚试剂法(Lowry法)

用于蛋白质测定的Lowry反应是双缩脲方法的发展，第一步涉及到在碱性溶液中铜-蛋白质复合物的形成(蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应)，Folin-酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被铜-蛋白质复合物中蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
二、紫外法


蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。
三、凯氏定氮法


1、原理

蛋白质是含氮的有机化合物。样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨；氨与硫酸结合生成硫酸铵。加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数(如乳及乳制品换算系数为6.38)，即为蛋白质的含量。