干货分享 | RACE，跑步？no，是cDNA末端快速扩增技术！

生物科研实验室

一、RACE简介


本指南描述了新药申请或生物制剂许可申请药效综合汇总的建议内容。虽然生物制剂许可申请提交中没有要求药效综合汇总，申请者最好能提供药效综合汇总，因为它可以表现一致性评价和药物的优点。



本指南中的建议反映了FDA 目前关于信息的想法，一份药效综合汇总应当包含行业信息以提供完整的分析，该分析提供临床试验上可观察到之外的见解。本指南不适用于《公共卫生服务法》监管下的生物制品医疗器械。



药效数据综合汇总代替了第二章G部分，行业指南"临床和统计部分申请的格式和内容指南"。它还包含了2.7.3部分的概念框架和临床疗效的总结， ICH行业指南CTD格式M4E一一疗效。

二、经典RACE


1、3´-RACE



3´-RACE是利用真核生物mRNA的3´端具有polyA结构的特点，使用5´端带有接头序列的oligodT与之结合进行逆转录，获得cDNA
再利用根据已知序列设计的上游引物和与接头序列互补配对的下游引物进行PCR扩增，得到cDNA的3´末端扩增产物。



引物一：oligo(dT)17和一个35bp的接头(dT17-adaptor)，；引物二：一个基因特异性引物，扩增的特异性取决与其cDNA分子互补。引物三：接头引物，用接头引物来取代dT(17)-adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。



2、5´-RACE



5´-RACE是利用根据已知序列设计的下游引物GSP作为逆转录引物，合成一链cDNA；再用末端脱氧核苷酸转移酶和dATP在新合成的cDNA的3'末端加上polyA。
https://iivd.net/forum.php?mod=attachment&aid=MTE2NTR8NTIwMjRiNzR8MTc2NDI3NDEzM3wwfA%3D%3D
接着用带有接头序列的OligodT引物与一链cDNA的3'末端的polyA结合，合成二链cDNA；再以第二链cDNA为模板，利用GSP和接头引物作为上下游引物进行PCR扩增，得到cDNA的5'末端扩增产物。

三、Adapter-Ligated RACE


在获得mRNA的过程中或多或少会产生很多断裂的mRNA短片段，Adapter-Ligated RACE技术是为了获得更长的mRNA序列，但相对来说不一定能获得全长mRNA序列。
Adapter-Ligated RACE是利用T4连接酶将接头连接到cDNA的两个末端上；在PCR循环的退火步骤中，由于短cDNA的退火温度低，两端接头容易发生退火，形成锅柄状结构，阻止引物与模板的结合，终止PCR反应。长的cDNA退火温度高，不易形成锅柄装结构，因此引物可以与接头结合，可进行PCR扩增。