8个引物设计秘诀，让PCR实验成功率飙升

科研顾问

今天给小伙伴们分享的是PCR引物设计的8大原则，直接上干货，设计引物的时候，我们都需要考虑哪些因素呢？

PCR引物设计的目的是确保PCR反应能够有效、特异性地扩增目标DNA序列。所以引物的好坏，直接关乎实验的成功。

1、引物长度：18-30nt，通常以20nt左右最为常用。上下游引物的长度最好基本相等，最多相差不超过3bp。引物过短，易导至非特异扩增；较长的引物虽特异性好，但在引物内易形成二级结构，如发夹环。

2、引物GC含量：40-60%，G+C比例太低扩增效果不佳，G+C比例过高易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免出现重复的基序。

3、引物的熔解温度：55-75℃，退火温度需要比解链温度低5℃。引物对之间的Tm的差异应不超过2-3℃。

引物的熔解温度（Tm）是指在特定条件下，DNA或RNA引物双链解链成为单链的中点温度。Tm值对于PCR反应的退火步骤至关重要，因为它影响引物与目标DNA的结合效率。计算引物的Tm值可以使用以下基本公式

对于短于20个碱基的引物，可以使用以下简化公式估算Tm：

其中，A表示腺嘌呤（A）的数量，T表示胸腺嘧啶（T）的数量，C表示胞嘧啶（C）的数量，G表示鸟嘌呤（G）的数量。

4、引物扩增跨度：普通PCR以200-500bp为宜，实时荧光PCR则为70-150bp。

5、引物的二级结构：引物设计最好跨内含子设计，避免出现发夹结构。某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响。

6、确保碱基的随机分布

引物设计中四种碱基的分步保持随机性，有助于提高引物的合成效率和PCR扩增的特异性，应避免设计包含5个或更多连续相同碱基的引物，如AAAAAAAA或CCCCCCCC。同聚物串可能导至非特异性扩增，并且可能在PCR过程中形成发夹结构或二聚体。

7、确保引物自身/之间没有连续4个碱基的互补

避免引物自身或引物之间出现连续4个碱基的互补非常重要，因为这可能导至非特异性扩增或影响PCR的效率。单个引物不应在其序列内部形成互补，这会促使发夹结构的形成，从而降低可用于扩增的引物浓度。一对引物（正向和反向）之间也不应存在连续4个碱基以上的互补，以防止它们形成稳定的二聚体。3'端稳定性：特别要注意引物的3'端，因为DNA聚合酶在3'端容易出错，如果3'端存在互补序列，可能导至非特异性扩增。

8、引物5'端可修饰，3'不可修饰

5'端修饰的常见目的：

标记与检测：在5'端添加荧光标记或其他标签，便于扩增子的检测和分析。

引入限制性酶切位点：为了将扩增的片段克隆到特定的载体中，可以在5'端添加限制性酶切位点序列。

引入突变：在5'端设计引物时，可以引入特定的点突变，用于构建突变体或进行定点突变实验。

增加引物的Tm：通过在5'端添加G或C碱基，可以提高引物的Tm值，有助于提高PCR的特异性。

提高引物的溶解度：有时在5'端添加一些非特异性的序列，可以提高引物在水中的溶解度。

3'端修饰的注意事项：

稳定性：3'端的稳定性对PCR扩增至关重要，因为DNA聚合酶在3'端添加核苷酸。如果在3'端引入修饰，可能会影响DNA聚合酶的延伸效率。

非特异性扩增：3'端修饰可能增加非特异性扩增的风险，因为修饰可能改变引物与模板DNA的配对方式。

错配容忍度：DNA聚合酶对3'端的错配容忍度较低，修饰可能会影响引物的特异性。

延伸效率：3'端的修饰可能影响DNA聚合酶的延伸效率，导至PCR产物的产量降低。