玄学”Western blot ( WB)-内参你选对了吗？

科研CRO

在 Western Blot 实验中，内参是指用于标准化蛋白质表达水平的参照蛋白。内参通常是一种在细胞中普遍表达且表达水平相对稳定的蛋白质，其表达水平不受实验条件或处理的影响。我们跑Western blot除了想知道目的蛋白在细胞/组织中是否表达，更重要的是想知道表达量的高低。Western blot条带的[color=var(--weui-LINK)]灰度值能够帮我们判断目的蛋白的表达丰度，但前提是你最初的上样量是一样的，这个上样量指的可不是上样体积，而是你的蛋白浓度。所以我们需要内参来帮我们调整上样量，也就是用内参的信号来对目标蛋白的信号进行标准化。

以下是一些选择内参蛋白的考虑因素：

表达水平：内参蛋白应该在实验样本中普遍表达，且表达水平应该相对稳定，不受实验条件或处理的影响。通常选择表达量较高的内参蛋白，以便在 Western Blot 中检测到明显的条带， 检测多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用 GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定，而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。

分子量：内参蛋白的分子量应该与目的蛋白的分子量有明显差异，以便在 Western Blot 中能够区分目的蛋白和内参蛋白的条带。通常选择分子量较大或较小的内参蛋白，以避免与目的蛋白的分子量重叠，一般我们选择内参与要检测的蛋白分子量最好相差5kDa以上。

物种来源：内参蛋白应该与实验样本的物种来源相同，以避免种属间的差异。如果实验样本来自不同的物种，可以选择在多个物种中表达相对稳定的内参蛋白。

细胞类型和组织类型：内参蛋白的表达水平可能因细胞类型和组织类型而异。因此，在选择内参蛋白时，应该考虑实验样本的细胞类型和组织类型，选择在相应细胞类型和组织类型中表达相对稳定的内参蛋白。

实验条件：某些实验条件可能会影响内参蛋白的表达水平。例如，用缺氧、诱导糖尿病等处理时，由于GAPDH的表达增高，不能用来做内参。因此，在选择内参蛋白时，应该考虑实验条件对其表达水平的影响。