手把手教学——miRNA的逆转录和荧光定量PCR

生物科研实验室

microRNA（miRNA）是一种长度约为19-25nt单链RNA，一般参与转录后调节基因表达。作为非编码RNA（ncRNA），目前大量的研究显示一些差异表达miRNA在众多的疾病中扮演者重要的角色，而了解miRNA差异表达，荧光定量PCR是最基础、应用最广的检测和定量miRNA的方法。

由于miRNA的长度比较短，因此传统的荧光定量并不适用，下面介绍的两种方法的最根本的原理其实就是延长miRNA。因此在这里分享了关于miRNA进行qPCR的两种方法和一些经验总结：

一、提取细胞、血清或外泌体RNA

就目前而言，针对不同样品TRIZOL法提取RNA是比较通用的提取RNA的试剂，但是也具有相应的提取试剂盒（血清RNA提取试剂盒），目前一般均使用的是TRIZOL法提取的total RNA进行后续实验，但有文献说明TRIZOL法可能会导至miRNA丢失，也可选择miRNA提取试剂盒。TRIZOL法之前有分享过详细的步骤，这里就不在详细阐述了。



二、miRNA的qPCR

1. miRNA茎环法逆转录+miRNA荧光定量PCR

原理：在逆转录过程中我们需要设计一个茎环引物与我们miRNA序列结合起到延长miRNA的作用。而茎环引物是一个长度约为45bp且能够自身环化的引物。每一个miRNA都具有自己特异的茎环引物，这最重要的原因就是设计的茎环引物中包含一段与miRNA互补序列有关：茎环逆转录引物=5’端的茎环序列+3’端的miRNA的特定互补序列。



①茎环引物的设计：

首先我们在miRBase数据库中查询到miRNA的成熟序列(5’-3’)，利用excel中的替换功能将序列中的U全部换成T，一般地通用的茎环引物序列如CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC3’ 或者
5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC3’，红色部分的序列可形成自身环化。

另外，针对特定miRNA设计的茎环引物：只需要在通用茎环引物3’端加上miRNA的成熟序列中的U更换成T后的序列3’端开始数6-8个碱基（一般选择6个）的反向互补序列加在茎环通用序列的3’端即可，这样就得到某个miRNA的茎环引物。

以hsa-miR-30b-5p为例，其成熟序列为UGUAAACAUCCUACACUCAGCU，U全部换成T：TGTAAACATCCTACACTCAGCT；则其茎环引物为：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′



②逆转录（RT）：去除基因组DNA+逆转录（可使用miRNA专用的茎环法逆转录试剂盒）

1)去基因组DNA（2ul 基因组去除试剂）；

2)RNA体积：根据提取RNA浓度来定+free-RNase H2O(to 10 ul)；

3)吹打混匀，42℃反应2min

4)逆转录：1ul茎环引物（stem-loop）+试剂盒中逆转录MIX（2ul+2ul）+free-RNase H2O（5ul）(to 20 ul)

5)一般来说，一次逆转录只能进行一个miRNA的单独逆转录，但是根据实际情况而言，我们可以将miRNA+内参U6混合在一管中一同逆转成cDNA。

根据以上试剂盒设计的加样量，我尝试过一管内混合逆转录内参+5个miRNA，其中主要的变化就是在第一步增大所加入RNA的量，在第二步加茎环引物时，我们可以将所加入的free-RNase H2O（5ul）替换成不同的茎环引物(5个)，这种方式在特异性的基础上又比较高效的合成多个miRNA，虽然节省试剂，但是也存在弊端，例如我们加入Mix(包含酶或dNTP等)都是一定量的，加入过多的茎环引物合成最终的各种miRNA的cDNA产物可能存在浓度过低，混合不匀可能会影响后续的荧光定量。



③荧光定量（qPCR）

1)荧光定量引物的设计：由于茎环引物存在一段通用序列，因此使用的反向引物（下游引物）一般也是通用的且试剂盒会配备有，此时我们只要设计特异的正向引物（上游引物），在遵循引物设计原则（长度18-26bp；GC含量：40%-60%；Tm:55-60℃）的基础上，正向引物=自身成熟序列去除茎环引物中的6个碱基5’-3’端剩下的碱基:正向引物：TGTAAACATCCTACAC，但是一般我们会对引物进行调整，与下游引物的Tm值相适应，调整荧光定量PCR的引物长度在5’端增加碱基C/G。茎环序列为：
5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′，则通用反向引物为：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′

2)荧光定量：10ul体系（20ul体系减半）(SYBR染料法)：

5ulSYBR+1ulcDNA+2ulfree-RNase H2O+2ul正反引物（提前混合）