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科研顾问

1、细胞准备

（1）取出生长状态良好的细胞，弃培养基，消化重悬细胞。

（2）将24孔圆形爬片放入24孔板的孔中。

（3）根据细胞生长特性取适量细胞于已铺爬片的24孔板中，放入37℃孵箱培养。

2、固定

（1）取出细胞，弃去培养基，用PBS洗细胞3次。

（2）每孔加入1mL的4%多聚甲醛，室温固定10-20min，弃去多聚甲醛；

（3）加入1mL的PBS清洗细胞，重复两次。

3、通透

（1）每孔加入1mL的0.5% Triton-X100 ，室温10min，弃去Triton-X100。

（2）加入1mL的PBS清洗细胞，5min，弃PBS。重复两次。

4、封闭

每孔中加入1mL的3%BSA封闭液，室温封闭1h。弃封闭液。

5、一抗结合

（1）向爬片上滴加稀释好的一抗，用锡箔纸包住24孔板外面，轻柔的将24 孔板放置于4℃冰箱中，过夜孵育。

（2）加入1mL的PBS清洗细胞，5min，弃PBS。重复五次。

6、二抗结合

（1）加封闭液稀释的二抗室温避光孵育1h。

（2）加入1mL的PBS清洗细胞，5min，弃PBS。重复五次。

7、DAPI染色

（1）按照1：4000比例用1×PBS稀释DAPI工作液（参照厂家说明书），并向每个孔中加入1mL的DAPI工作液，避光静置染色10min。

（2）加入1mL的PBS清洗细胞，5min，弃PBS。重复三次。

8、封片及检测

（1）将爬片小心取出，用吸水纸吸干多余液体，加5μl的抗荧光淬灭剂到载玻片上。

（2）将爬片倒置载玻片上，周围涂指甲油固定。

（3）4℃暂存或直接激光共聚焦显微镜拍摄。