干货分享 | PCR实验，需要哪些组分/条件，值得收藏！

生物科研实验室

一、PCR反应组分


1.模板DNA：

来源比较广，用于复制的PCR模板可以是任何DNA来源，如基因组DNA（gDNA）、互补DNA（cDNA）和质粒DNA。不过，DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。例如，在起始量为50µL 的PCR中，只需0.1–1 ng质粒DNA，而gDNA则需要5–50ng。最佳模板起始量还取决于所使用的 DNA 聚合酶类型；经过改造 的DNA聚合酶对模板的亲和力更强，灵敏度更高，所需的DNA起始量更少。对DNA起始量的优化很重要，因为起始量过高会增加发生非特异性扩增的风险，而起始量过低会降低得率。



有时候，PCR实验方案会使用拷贝数表示DNA起始量，特别是gDNA。拷贝数的计算取决于分子的数量，即DNA起始摩尔量。用Avogadro常数（L）和摩尔质量计算拷贝数，公式如下：



拷贝数=L×摩尔数=L×（总质量/摩尔质量）



特定DNA链的摩尔质量取决于其大小或总碱基数（即其长度和单链或双链特性的组合）。



理论上，单拷贝DNA或单个细胞在理想条件下足够用于PCR扩增。但在实际情况中，特定模板量的扩增效率很大程度上取决于反应组分和反应参数，以及DNA聚合酶的灵敏度。



除了gDNA、cDNA和质粒DNA，可通过再次扩增PCR产物，得到更高的目标DNA得率。尽管未纯化的PCR产物可以直接再次用作模板，但是引物、dNTP、盐和副产物等遗留反应成分会对扩增造成不利影响。为了避免这种抑制作用，通常建议在下一轮PCR前用水稀释反应。如需获取最佳结果，应在再次扩增前将PCR扩增子进行纯化。



模板DNA的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。



2.脱氧核苷三磷酸（dNTP）：

四种dNTP（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）是PCR原料，其比例和浓度与PCR密切相关。dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应用1M NaOH或1M Tris配成高浓度后，HCI的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200 μmol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。但是，在某些情况下，如通过PCR方法进行随机突变，偶尔也会使用浓度不等的dNTP，以促进非校正DNA聚合酶产生更多的错误碱基插入。



dNTP储存液：dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到10mol/L，分装后存放在-20℃冰箱中。dNTP使用浓度在20～200μmol/L之间。4种dNTP必须等浓度配合以减少错配误差。



dNTP使用浓度：在PCR反应中，使用低dNTP浓度，可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。在常见的PCR应用中，各种dNTP的常用终浓度通常为0.2mM。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。例如在100μl的反应体系中，4种dNTP的浓度为20 μmol/L，可基本满足合成2.6μgDNA或10pmol/L的400bp序列。使用低dNTP浓度(每种dNTP浓度为2μmol/L)，能够高度灵敏地(1/107)扩增ras基因点突变的等位基因。



有时，使用高浓度dNTP也可能也是有益的，特别是在存在高浓度 Mg2+的情况下，因为Mg2+可与dNTP结合，减少可被引入的dNTP量。但同时，当dNTP超过最佳浓度时，会抑制PCR反应。为使DNA聚合酶完成有效扩增，反应中的游离dNTP浓度不得超过 0.010–0.015mM（其估计Km值）。当使用非校正DNA聚合酶时，可通过降低dNTP浓度（0.01–0.05 mM）和成比例减少 Mg2+来提高保真度。



3.Taq DNA聚合酶：

DNA聚合酶是PCR的重要组成部分，它们能够从单链DNA模板合成新的互补链。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即掺入核苷酸并使引物从按5'至3’方向延伸。

早期的PCR，通常使用来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 来生成新的子链。但是，这种大肠杆菌酶对热敏感，易受到变性阶段高温度的破坏，从而无法继续进行退火和延伸步骤。因此，需要在全程每个循环的退火步骤中重新补充酶。



热稳定DNA聚合酶的发现是一项重大进步。它实现了长时间的反应稳定性，为PCR方法的改进提供了无限可能。1976年，从耐热菌Thermus aquaticus中分离出来的Taq DNA 聚合酶是最有名的热稳定DNA聚合酶之一 。1988年研究人员首次报道，证明TaqDNA聚合酶能够在 75℃以上保持活性，从而无需手动加入新鲜的酶即可持续循环扩增，实现了工作流程自动化。此外，与大肠杆菌 DNA聚合酶相比，Taq DNA 聚合酶能够获得更长的PCR扩增子，并且具有更高的灵敏度、特异性和得率。也因此，Taq DNA 聚合酶被《科学》杂志评为1989年的“年度分子”。



尽管 Taq DNA聚合酶大大改善了PCR实验方法，但也表现出一些缺点。例如，Taq DNA 聚合酶在90℃以上的DNA链变性温度中相对不稳定。对于需要更高解离温度的富含GC和/或具有强二级结构的DNA模板而言，这一问题尤为明显。同时，Taq DNA 酶还缺乏校正活性，会在扩增期间引入错误核苷酸。对于克隆和测序而言，序列的准确性至关重要，所以不能存在含有错配的PCR扩增子。此外，Taq DNA 聚合酶的易错配特性使其通常无法稳定扩增长度大于5kb的片段。为克服这些缺点，性能更好的DNA聚合酶不断被开发出来，使PCR在广泛的生物学应用中发挥其强大的功能。



目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化--典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100 ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。



4.引物：

PCR引物是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸。能够与模板DNA中目标区域的侧翼序列结合（通过序列互补）。在PCR反应期间，DNA聚合酶从 3′端开始延伸引物。因此，引物结合位点必须是靶标附近所特有的，并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性，以确保目的片段的特异性扩增。



除了序列同源性，引物还必须考虑到其它相关问题，，以确保PCR扩增的特异性。首先，引物序列的熔解温度（Tm）必须在 55–70℃之间，两种引物的 Tm相差不超过 5℃。同样重要的是，引物的序列不能具有互补性（特别是3’末端），若两个引物互补会促进退火（即，引物二聚体），自我互补会导至自我配对（即，二级结构），或序列的直接重复会导至与模板目标区域产生不完全配对。引物的GC含量最好在40-60%之间，均匀的C和G分布能够避免错误发生。同样，为了尽量减少非特异性，引物3′端最多只能含有3个G或C碱基。另一方面，引物3′端含有1个C或G核苷酸有利于引物的锚定和延伸。
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。



长序列引物（如，>50 nt）或碱基经修饰的引物通常需要进行 纯化 ，以去除非全长产物和未结合的核苷酸。对于分子克隆和突变等应用，建议将引物进行纯化，序列和长度的完整性对于实验的成功至关重要。



为PCR克隆设计引物时，可在5'末端引入限制性酶切位点、重组序列和启动子结合位点等延伸的非模板序列。这些延伸序列需进行精心设计，以尽量减小对PCR扩增和下游实验应用的影响。



在配制PCR反应体系时，引物加入量应在0.1–1μM范围内。对于含有简并碱基或用于长片段PCR扩增的引物，常用的引物浓度为0.3–1μM 。通常，建议先使用标准浓度，然后根据需要再进行调整。引物浓度过高容易产生错配和非特异性扩增。而引物浓度过低可能会导至目的片段的少量扩增或无扩增。



5.镁离子（Mg2+）：

镁离子（Mg2+）作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外，Mg2+  能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物。
通常情况下，Mg2+ 以MgCl2 的形式提供。但是，因硫酸盐在某些情况下有助于确保更稳定和可重现的性能，诸如 Pfu DNA聚合酶等一些聚合酶首选MgSO4。由于镁离子能够与dNTP、引物、DNA模板和EDTA（如果存在）结合，因此，通常需要对镁离子浓度进行优化，以尽量提高PCR得率，并保持其扩增特异性。



在PCR中，标准的 Mg2+ 终浓度范围为1–4mM，建议优化滴定增量为0.5mM。Mg2+ 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶活性，导至PCR产物较少或无PCR产物。另一方面，Mg2+ 浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性，反应特异性降低，产生非特异性PCR产物，并增加由dNTP错误插入导至的复制错误。



6.缓冲液：

用于维持DNA聚合酶的活性和稳定性。缓冲液pH通常为8.0-9.5，一般使用Tris-HCl来调节。



对于 Taq DNA 聚合酶，缓冲液的一个常见成分是来自KCl的钾离子（K+)，其可促进引物的吸附。有时，也可使用硫酸铵(NH4)2SO4 代替KCl。铵离子(NH4+) 具有去稳定作用，尤其对于错配引物-模板复合物碱基对之间的弱氢键，因此可增强反应特异性。
二、PCR反应条件


1.变性温度与时间

模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性，一般情况下可设为94℃ 20-30秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热DNA聚合酶的活力，最高变性温度不宜超过95℃。



2.退火温度与实践

退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45-68℃之间。设置特定反应的最适退火温度，可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为30-60秒，足以使引物与模板之间结合，没有必要长时间退火。



3.延伸温度与时间

PCR反应的延伸温度一般选择在70-75℃之间，延伸时间根据所有聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定。如同样扩增2kb片段，若使用Taq酶只需要1分钟，使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导至非特异性扩增带的出现。时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。



4.循环次数

可根据模板DNA的量，扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设定30-40个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。