免疫组化的二抗还有区别的么！要怎么选？

病理医师

免疫组化大家基本上都做过，你知道有二抗，也应该知道免疫组化的原理就是一抗结合到目标蛋白，再有二抗来进行信号放大，大概是这样：

但是你知道二抗的信号放大实际上有多种方法……这就需要你进行二抗标记方法的选择，简单的二抗标记方法是直接法：

就是直接在二抗上标记酶，比如HRP，来进行显色，这样的二抗实际上很便宜，但是缺点就是灵敏度低，好多低丰度的蛋白，结合不上，免疫组化染出来的效果就不太好。

第二种方法，叫做PAP，比如二抗标记了HRP，他们就在孵育二抗后，再孵育一种能结合HRP的一抗，就像这样：

这种方法灵敏度是上去了，但是非特异性增高了，于是被主流淘汰了。

第三种方法被称为ABC法或者SABC法，主要是在二抗上标记生物素，孵育二抗后，加入亲和素以及标记了HRP的生物素，以这样的聚合方式，来进行信号的放大作用：

这种方法的优点是能够成倍提高灵敏度，但同时也会提高非特异性，于是就产生了第四种方法，LSAB法标记的二抗：

这种方法，直接在亲和素上加上HRP标记，灵敏度也很高，同时降低了SABC法的非特异性。而且，LSAB法在实验的时一般孵育时间短（通常就10分钟）。

但SABC法和LSAB法在实验过程中会需要进行内源生物素封闭，会麻烦一些。为了省去麻烦，就产生了第五种标记方法，也就是Polymer法，就是在二抗上标记聚合的HRP：

这样二抗的信号就得到了放大，灵敏度也提高了，但Polymer法、SABC法、LSAB法，都不能用于定量实验，只能用在IHC上。

那免疫荧光呢？免疫荧光主流是采用直接法、LSAB法，以及直接标记或者LSAB标记的三抗来进行信号放大的。总结一下，就是直接法的二抗便宜但是灵敏度差；PAP法基本已经淘汰，LSAB和SABC法的灵敏度高，但是贵，步骤多；Polymer法灵敏度高，步骤简单，但是贵。