RT-qPCR中的定量策略详解

科研小助理

MIQE指南是关于qPCR实验发表文章时所必需的实验信息提出的最低限度的标准。目的是让作者能够设计和报告更有价值的qPCR实验，使评阅人员和编辑按照相应的标准来评价所提交的文稿的技术质量，使读者更容易重复按照该指南发表的实验研究。本文小编将为大家详细介绍如何应用MIQE指南来指导RT-qPCR中的定量策略。

1、前言

当准备进行qPCR实验时，首先需要确定实验该如何设计，要做绝对定量还是相对定量呢？绝对定量要怎么做？相对定量又是怎么做？本文将重点介绍量化策略类型的优缺点，从而深入了解其局限性以及RT-qPCR效率如何影响量化结果。

2、定量策略

绝对定量使用标准 (或校准) 曲线将PCR数据与输入拷贝数相关联。因此，该校准曲线用于确定未知分析物的浓度。尽管传统上称为 “绝对定量”，但最好将这种方法称为 “校准定量”。这是因为，在这种情况下，“绝对” 一词具有误导性，因为现场样品的浓度实际上是与校准曲线中使用的标准样品的浓度 “相对” 测量的。此外，数据的可靠性还依赖于RT-qPCR中待测靶标和标准曲线的 “相同” 的扩增效率。

相对定量不需要校准曲线。由于这个原因，乍看比绝对定量更容易执行。相对定量用于测量mRNA表达相对于所选对照样品的变化，它主要基于靶基因相对于一个或多个内源性表达参考基因（管家基因）的表达。相对定量方法对于大多数实验目的是足够的，例如研究mRNA或microRNA基因在不同生理条件下的表达变化。用于表示相对量的单位通常为 “x倍变化”，并且可以在多个实验中比较相对量。

3、绝对定量

绝对定量需要用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量，将标准品稀释成不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Cq值为纵坐标绘制标准曲线：Cq= -klgX0+b。对未知样品进行定量时，根据未知样品的Cq值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。

从上图可以发现，当模板起始浓度越大时，荧光达到阈值的循环数越少，即Cq值越小。反之，模板起始浓度越小时，Cq值越大。

为了保持与实际检测样品间的扩增效率的一致性，作为标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品。以基因组DNA为模板时就要选择基因组DNA作为标准品；进行mRNA表达解析时最好选择表达目的基因的Total RNA(或以Total RNA为模板合成的cDNA)作为标准品。即使扩增碱基序列相同，但整体模板不同，也有可能导至PCR扩增效率不同（比如基因组DNA和质粒DNA等）。

建立标准曲线，需要已知拷贝数浓度的标准品，对标准品进行5个以上的连续梯度稀释，将稀释的标准品进行实时荧光定量PCR扩增。最后根据各样品的拷贝数浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程：Cq=-klgX0+b，其中X0为起始模板量。然后将未知样本的Cq值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数。

4、相对定量

相对定量是用于测定两个或多个不同样品中靶基因量的差异，得到的数据是目的基因在各样本中含量的相对比例。即将实验样本中靶基因的Cq值与对照样本的Cq值进行比较，结果用实验样本中靶基因量与对照样本中靶基因量的比值或差异倍数来表示。该方法在qPCR定量检测mRNA水平中最常见，研究生理变化对基因表达水平的影响。比如研究不同药物处理对Actin基因表达量的影响，就可以使用相对定量方法来研究。

相对定量需要确保实验样本与对照样本的靶基因从等量原料中得到。Cq值与起始样品模板量的浓度相关，但是两组样品间浓度能否调至完全相同呢？这就要求样品细胞起始数、RNA 提取效率、逆转录以及定量效率及操作必须完全一致，不存在操作误差等，这显然是无法达到的。最常用的是引入内参基因对样本的差异进行归一化。

5、内参基因选择

选择合适的单个参考基因或选择合适的参考基因组对于准确的RT-qPCR基因表达分析是极为关键的，并且是MIQE指南的必需报告内容。理想的内参基因应该具备以下几个条件：

① 不存在假基因 (pseudogene) ，以避免基因组DNA的扩增；

② 高度或中度表达 ，排除太高或低表达；

③ 稳定表达于不同类型的细胞和组织 (如正常细胞和癌细胞 )，而且其表达量是近似的，无显著性差别；

④ 表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；

⑤ 其稳定的表达水平与目标基因相似；

⑥ 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。

针对在不同条件下表达差异的基因、呈现细胞周期性依赖表达的基因以及定位于X染色体的基因，都不是作为内参基因的首要选择。

6、RT-qPCR数据的归一化

相对定量时采用内参基因进行归一化，然后使用将归一化的数值进行比较得出差异倍数。对照样本的归一化后靶基因表达量被设置为“1”，实验样本的归一化后靶基因表达量以对比对照样本增加或降低x倍来表示。

相对定量的数据计算方法通常有2种：相对标准曲线法和比较Cq值法。标准曲线法中，先用标准曲线确定实验样本和对照样本中靶基因和内参基因的量，再用内参基因归一化两个样本中靶基因量。相对定量中的标准品的浓度无需已知。由于标准曲线法需要每一个待测基同内参基因一起单独做标准曲线，工作量大，成本高，只适合仅分析1个或几个基因的低通量实验。因此日常实验中常用的方法是比较Cq值法，即2-△△Cq法，计算方法如下：

步骤1：内参基因均一化样本差异

目的基因平均Cq值-内参基因平均Cq值=ΔCq

步骤2：处理和对照样本比较

ΔCq处理样本-ΔCq对照样本=ΔΔCq

步骤3：使用公示计算

倍数变化=2-△△Cq此公式用于计算所有待测样本与对照样本之间目的基因表达量的倍数变化，若F值=A（A＞1），则代表待测样本相对于对照样本表达量上调A倍；反之若F值=B（1＞B＞0），则代表待测样本相对于对照样本表达量下调1/B倍。

值得注意的是，2-△△Cq法需保证目的基因和内参基因的扩增效率基本一致才可使用。同时扩增目的基因和内参基因，通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相似；或制作标准曲线计算每一对引物的扩增效率。

7、RT-qPCR扩增效率

PCR的效率取决于许多因素，既存在抑制剂也存在增强剂，如下图所示。在所有比较样品中稳定和恒定的扩增效率是样品之间实现可靠比较的一个重要标准。

一种有效的用来确定 qPCR 实验是否是最优化的方法：将模板稀释成一系列浓度梯度进行 PCR 反应，用这个结果作标准曲线，模板可以用已知浓度的样品(如纳克级的基因组DNA 或多个拷贝的质粒DNA)或未知浓度的样品(如cDNA )。用模板初始量(或未知量样品的稀释倍数 )的log值对每个稀释样品的Cq值作图，两者呈递减的线性关系，称之为标准曲线。至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度，绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b。

理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距，如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距由等式2n=稀释倍数决定，这里n是阈值线上扩增曲线之间的循环数(Cq值) 的差异。例如，10倍稀释的DNA样品，2n = 10，因此，n =3.32，即k=3.32，制作完标准曲线后，需要对其进行评估，评估指标有两个，相关系数R2和扩增效率（E）。相关系数R2反应了数据的线性关系，主要用来评估重复样品的可重复性和不同浓度的初始模板是否具有相同的扩增效率。R2值应大于0.98，该值越接近1，表示线性关系越好，数据越准确。

扩增效率（E）计算公式：E=10-1/斜率-1。一般认为扩增效率应介于90~110%之间，与之相对应的斜率介于-3.58~-3.1之间。

8、使用效率校正计算基因表达倍数

由于PCR效率在基因、测定、样品、试剂和仪器之间变化，引入实时PCR效率（E）校正有助于提供更准确的相对定量。然后将相对倍数变化定义为：

在这种情况下，计算步骤如下：

1.计算对照样品（control）和待测样品（treatment）之间目的基因（GOI）的Cq差异。

2. 计算对照样品（control）和待测样品（treatment）内参基因（REF）的Cq差异。

3. 确定每个基因（GOI和REF）的PCR扩增效率。

4. 相对表达比（R）代表与未处理对照组相比，一个GOI经历处理后的“x倍变化”，用REF的稳定表达进行归一化，计算中采用REF或GOI基因的最佳PCR效率E。

9、总结

用于可靠的mRNA或microRNA定量策略必须根据需要解决的生物学问题去设计。为了做到真实、可信和符合MIQE指南要求，所应用的定量策略必须经过高度优化和验证。近年来，科学家已经开发出许多软件工具使定量过程标准化并使结果可再现。这些工具及MIQE指南应用最终目的是降低运行、检测和所用SOP之间的实验室内变异性。此外，也有利于实时RT-PCR平台、分析软件工具之间以及全球不同实验室之间的结果的标准化和可比性。

根据实验目的的不相同，相对定量和绝对定量各有其不同的应用场景。绝对定量更多的应用于：病原体检测、转基因食品检测、基因表达研究。相对定量则更多的应用于：基因在不同组织中的表达差异、药物疗效考核、耐药性研究等。