PCR反应中的主要成份有哪些？

生物科研实验室

PCR反应中的主要由引物、 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、Mg2+、模板和Taq DNA聚合酶五个成份组成。各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。
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引物



PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：



（1） 引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。



（2）引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。



（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样易导至错误引发。



（4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。



（5）在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。



（6）两引物之间尤其在3'端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。



（7）引物5'端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。



（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。



（9）简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的Met， 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。



（10）一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0 μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可精确计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：



X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)



X：引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。
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4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)



（1）dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。



（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200 μmol/L。



（3）理论上4 种 dNTP各20 μmol/L，足以在100 μl反应中合成2.6 μg的DNA。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
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Mg2+



（1）Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。



（2）通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2 mmol/L.对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5 mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。



（3）在PCR反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。
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模板



（1）PCR反应必须以DNA为模板进行扩增， 模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。



（2）就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少。



（3）灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。



（4）模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
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Taq DNA聚合酶



一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。



Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min，掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。



所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。



反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA聚合酶， 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：



（1）PCR产物经酚: 抽提，乙醇沉淀。



（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。



（3） 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
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反应缓冲液



（1）反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。



（2）反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。



（3）各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。