干货分享 | 无缝克隆常见问题解答

生物科研实验室

分子克隆实验——无缝克隆

今天和大家讲讲无缝克隆常见的问题以及解决方法。



1.平板上很少或者没有克隆菌落



建议使用试剂盒附带的阳性对照，可排除试剂盒本身的影响。进一步判定，主要有以下可能的情况和建议：

01
载体制备
线性化载体和插入片段的纯度不够，抑制反应。

02
插入片段制备
1、引物设计不正确：同源臂15~25nt（不计算酶切位点）,CG含量40~60%。


2、线性化载体和插入片段的纯度不够，抑制反应。若线性化载体与插入片段已经过纯化，且经电泳检测条带单一或无 Smear 残留时，可使用超微量核酸蛋白检测仪进行浓度测定，当 A260/A280 在 1.8~2.0 之间时，浓度值可信，未纯化的DNA使用体积不能超过反应体积的1/5。

03
无缝克隆
线性化载体和插入片段的投入量不足或过量，比例不佳：按照明书推荐的最适用量和比例配制反应体系。

04
转化
感受态效率低：感受态转化效率大于108 cfu/ug，重组产物的体积不能超过感受态的1/10。



2.多数克隆不含插入片段（假阳性）



主要有以下可能的情况和建议：

01
载体制备：
✿载体线性化不彻底：设置阴性对照检测载体是否线性化完全。

✿相同抗性的质粒污染：以质粒为模板进行插入片段 PCR 扩增时，使用预线性化质粒作为扩增模板，使用 DpnI 等甲基化敏感型内切酶对扩增产物进行处理，或对产物进行胶回收纯化。

02
插入片段制备：
插入片段的制备产物不特异：优化PCR体系（Tm,模板投入量，循环数等），提高特异性；胶回收PCR产物。

03
克隆筛选：
平板抗性不足：确保使用正确的抗生素，并使用新鲜制备的抗生素平板。



3.菌落PCR无条带



主要有以下可能的情况和建议：

01
载体制备：
重组失败：若只有空质粒条带，表明重组失败，载体线性化不彻底，优化酶切体系或PCR体系。

02
插入片段制备：
引物不正确，使用通用引物或者至少一条通用引物进行菌检。

03
克隆筛选：
PCR体系或者程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，优化PCR体系和程序（Tm，模板投入量，循环数等）；进行提质粒做模板，进行PCR验证或者酶切验证。