荧光原位杂交实验（FISH）步骤详解和注意事项

生物科研实验室

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是 20 世纪 80 年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。



FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于 DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。



杂交所用的探针大致可以分类三类：



1）染色体特异重复序列探针，例如 α 卫星、卫星 III类的探针，其杂交靶位常大于 1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；



2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；



3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。



探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测 500bp 的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。



1，对于FISH操作来说，那些因素比较重要？



在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度，因此探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片且避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这也直接关系到FISH的稳定性。



2，如何保证FISH操作中的温度？



最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作，如Vysis的Hybrit FISH杂交仪。如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内）。



其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。同时检测的样本最好不能超过4块。操作中的行动一定要迅速。操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。



特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。因此对上述小部件的要进行预热处理，不然会影响FISH的杂交效果。



3， 使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号，但随后信号急剧衰减，几分钟后信号就消失了。这是探针本身的质量问题吗？



正常情况下，商业化探针即使是杂交后，如保存适当，荧光信号能保持半年以上。出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。



阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。因此在操作和观察时，尽可能在暗室中操作，也可以在封片观察时加入一定的antifade（抗淬灭剂）以延缓荧光素的淬灭。



4，如何配制各种试剂呢？



强烈建议使用灭菌去离子水配制各种所需的试剂。此外，配制后使用pH计检测是否符合要求。配制的各种试剂都要采用超纯级要求。每次FISH使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。洗脱液和变性液当天用当天配。



5，直标型探针和间标型探针有何不同？



为什么我们要选择直标型探针？所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。



与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在FISH检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。



6，能对同一样本进行多次的FISH操作吗？



在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。如果我们使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。针对不同的样本，处理方法略有不同。



外周血样本的处理：



1、使用镊子小心地揭去杂交区的盖玻片



2、将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。对于多次杂交，复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度。



曾有报道在同一样本片上进行了多达8次的FISH操作。也可对已经进行G带显色的样本片进行FISH操作：将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。



二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。



7， FISH技术有哪些主要优势？



① 安全、快速、灵敏度高；



② 探针能较长时间保存；



③ 多色标记，简单直观；



④ 可用于中期染色体及间期细胞的分析；



⑤ 可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。



8，原位杂交技术的发展前景如何？



FISH 技术作为连接分子生物学与细胞生物学的桥梁地位已为世人所公认。



尽管目前FISH技术无法达到百分百完全杂交，特别是在应用较短cDNA探针时存在杂交效率明显下降的问题，但随着各种新型分子探针以及更为精密高端的光学显微镜和功能强大的计算机分析系统的不断问世，上述问题将会逐步得到解决，该技术的作用正变得日益重要，应用领域也得以不断扩展。FISH技术在泌尿系统肿瘤研究领域的巨大潜力与光明前景将引领我们进入全新时代。