Western blot实验避雷指南

生物科研实验室

Western blot是一个非常基础的实验，但是着实让我们头疼，即使是老手也挡不住WB实验的千锤百炼，懂得都懂，下面小编根据经验总结一篇WB实验过程会遇到的常见问题及解决方案，希望对正在做WB实验的小伙伴提供一个避雷参考！

无条带

1.蛋白表达量低：充分了解研究的蛋白，表达量低适当增加上样量，20-50μg。

2.本底表达还是诱导表达，非特异性条带。

3.样本提取蛋白使用蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，并设置对照，避免蛋白降解。

4.检查一抗特异性是否适合目的蛋白的种属，看说明书，一抗二抗最好买经过验证的。

5.蛋白转膜效率低：可以丽春红染色检查转膜效率,分子量小的蛋白，注意用小孔茎的膜。

6.适当调整优化转膜的时间和电流。

7.分子量表达低的选择超敏的发光液。

有阳性条带，但条带比较弱

1.抗体染色不充分：增加抗体浓度，延长孵育时间。

2.酶活性降低：直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

3.标本中靶蛋白含量太低：增加标本上样量。

4.洗膜过度：缩短洗涤时间。

5.HRP 抑制剂：所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

6.抗体活性降低：选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。

7.封闭过度：减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。

8.曝光时间过短：延长曝光时间。

9.HRP 抑制剂：所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

背景高

1.上样量多：适当减少上样量。

2.洗膜不充分：增加洗液体积和洗涤次数，原则可以快洗慢孵育。

3. 阻断不充分：选择合适的封闭试剂，增加封闭液孵育时间，封闭浓度。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应。脱脂奶粉含有的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。

4.抗体过多：降低抗体浓度，使用单抗，减少二抗孵育时间

5.检测过程中膜干燥：保证充分的反应液，避免出现干膜现象。

6.曝光过度：缩短曝光时间。

7.蛋白降解：使用新鲜样本，加入蛋白酶抑制剂，在冰上操作。

8.膜的选择导至的高背景：用低背景的NC 膜替换高背景的PVDF 膜。

9.蛋白存在不同的剪切形式：查阅数据库文献，了解蛋白的特异性一抗。
非特异性条带或蛋白条带大小不对
1.蛋白降解：加入蛋白酶抑制剂，样本处理时在冰上操作。

2.目的蛋白有多个亚型，分子量都不同：查阅文献或数据库，了解目的蛋白的信息。

3.细胞系传代次数过多：选择传代少的原代细胞系进行样品制备。

4.目的蛋白具有多种修饰形式，如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等，查阅文献或数据库分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，确定该蛋白是否存在不同长度的编码mRNA。

5.蛋白有聚合体，如二聚体、四聚体和多聚体：SDS-PAGE 电泳上样前煮沸 10 min以增强蛋白质解聚变性。

6.上样量过高或抗体浓度过高：适当减少上样量和抗体浓度。

7.洗涤不充分

8.一抗特异性不高：重新选择或制备高特异性的抗体

条带弯曲，拖尾等不同条带问题

出现的问题

原因及解决方案

条带呈笑脸状 (︶)

1.迁移过快或电泳温度过高：降低电压或低温电泳。

2.配胶问题，凝胶不均匀冷却，中间冷却不好迁移过快：重新配胶，电泳槽老化换新。

条带呈皱眉状 (︵)

配胶问题，可能是装置不合适特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡或者凝胶两边聚合不完全。

条带弥散或拖尾

1. 蛋白上样量过多：降低上样量。

2. 电泳结束后未立即转膜：电泳后尽快转膜。

3. 蛋白降解：加入蛋白酶抑制剂。

4.样品核酸污染：可进行超声及核酸酶处理或样品有不溶物，可稀释，充分裂解或离心操作。

条带偏斜

电极不平衡或者加样位置偏斜。

条带向两边扩散，不完整

1.抗体孵育不均一，或未充分结合：增加抗体孵育时间，建议4℃过夜孵育。

2.抗体浓度偏低：使用高浓度抗体。

3.化学发光液未加均一：适当增加化学发光液的量。

4.反应时间不够：增加化学发光显色反应的时间。

条带空心

可能由于蛋白浓度过高导至的底物消耗完毕，建议稀释样本浓度。

条带有不均匀的污点

1.膜上有气泡：转膜时将PVDF膜慢慢贴胶上后，可以用玻璃棒轻轻滚动，以驱赶膜与浇之间的气泡。

2.设备污染：确保设备清洗干净。

3.孵育或洗涤溶液不足，确保孵育洗涤充分。

4.封闭液未混匀，确保混匀，使用新鲜的封闭液，避免颗粒不溶物。

5.膜被污染：实验操作人员戴手套和口罩，穿实验服，保持膜的干净。禁止用手直接触摸膜。

深背景出现白色反光条带

中心部位高浓度 HRP 将底物消耗过快，中间部位底物消耗完后无法发光。

1.蛋白上样量过多：降低蛋白上样量。

2.一抗二抗浓度过高：适当加大抗体稀释。

哑铃型条带

1. 配胶问题，可能拔胶时用力过猛，导至胶变形突起：重新配胶。

2. 蛋白质有杂质。

出现非均一性背景，脏乱

膜可能曾经干过：可在实验过程中要保证膜一直处于湿润状态。

蛋白转印效率低

分子量大的蛋白

1.甲醇浓度太高：降低甲醇浓度至 10%（V/V）以下。

2.蛋白结合时间不够：使用湿转代替半干转。延长转印时间。

3.蛋白凝胶浓度太高：降低凝胶浓度，转印 buffer 中添加 0.1%SDS，促进蛋白溶解。

分子量小的蛋白

1.小蛋白在膜上结合量少：使用蛋白结合能力更强的膜。增大 SDS-PAGE 凝胶浓度。

2.使用小孔径印迹膜，如 0.1μm 或 0.2 μm Protran 印迹膜。3.转印 buffer 中残留的 SDS 影响蛋白与膜的结合：转印 buffer 中不要有 SDS。转印前凝胶与转印 buffer 平衡至少 15min 以上。

4.转印 buffer 中甲醇浓度太低：提高甲醇的浓度（15%-20%）

5.蛋白结合时间不够：调低电压，延长转印时间。
分子量很小的蛋白质＜20KD，选择什么膜？

）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；

2）也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。

显影时，底片漆黑一片，是为什么？
1） 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善。

2）显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。

膜上出现反像

可能二抗偶联HRP的浓度过高，可适当降低二抗的浓度。

WB实验选择“丽春红”还是“考马斯亮蓝”染料？
Ponceau S 检测到的蛋白质水平为 200 ng 以上，与 PVDF、硝化纤维或尼龙膜兼容。考马斯亮蓝仅与 PVDF 膜兼容，但可以检测 50 ng 及以上的蛋白质。建议检测 50-200 ng 范围内的蛋白质，选择考马斯亮蓝。但是，在 CST，我们通常首选Ponceau S，因为它速度快、易用、柔和而有效。

Western Blot“淬灭”？
1.含HRP的抗体：抗体方面来说，可以采用适当降低抗体的浓度，发光实验时快速操作来解决“淬灭”的问题
2.发光液：可以选用发光稳定的ECL发光液来解决“淬灭”的问题。
如何选择蛋白Marker？

1.根据蛋白Marker分子量范围：尽可能选择分子量范围比较广的蛋白marker，以便适用于更多蛋白的检测。如果已经确定集中在大分子量蛋白或小分子量蛋白的检测，最好选择对应分子量范围的marker，以便获得更好的指示。

2.考虑使用预染蛋白Marker：因为预染Marker在电泳或转膜过程中可以被直接观察到，方便我们判断电泳的进程，如电泳是否发生异常或是否将目标蛋白完全分开等，也可以判断转膜的是否完全，转膜后还可以直接在膜上标记蛋白分子量。
3.考虑Marker条带数是否在分子量范围内分布均匀，没有广泛的空白区域。是否多种颜色，以便于快速识别不同的分子量大小。此外，五颜六色的Marker也为实验结果添加一抹亮色。还要注意选择条带锐利清晰的Marker，这样才能更精确的指示蛋白的分子量。

WB实验中如何正确设置内参？
1.根据实验样本的种属选择适合的内参。如哺乳动物组织或细胞通常用β-actin，GAPDH等，植物样本，可以选用Plant actin、Rubisco等。
2.根据目的蛋白的表达位置选择合适的内参。如要检测全细胞或细胞质中的蛋白表达，可以选择β-actin，GAPDH和β-Tubulin作为内参，如要检测细胞核中的蛋白，可以选用PCNA和TBP作为内参，线粒体蛋白的内参选择COX IV、VDAC1/Porin，胞膜蛋白内参Na+/K+-ATPase 等。

3.一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，以防止条带互相影响。

免疫组化和WB两个试验的一抗和二抗可以共用吗？
免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；WB可以特异性检测某个蛋白质分子，如抗体选择合适，灵敏度很高。WB进行定量，但是不能定位。
两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗？
可以，有时如果抗体特异性高且效价高，同时使用2种一抗，可在一张膜上检测2种不同蛋白。

膜蛋白或胞浆蛋白，WB操作需要注意什么？

如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，需要加上NaF去抑制磷酸化酶的活性，推荐使用商业化的混合抑制剂