实验室科普：酶切电泳，它为什么就是切不好？！

生物科研实验室

进行过PCR，请给你的目的基因一个家——质粒。
主要特点：

原始质粒3条带或更多带。
酶切质粒切开后跑的比原始质粒的超螺旋结构慢。
原始质粒的超螺旋结构展示的BP大小比质粒长度的预期大小要小。
具体原因可见：质粒电泳3条带？5条带？一文告诉你原因

问题汇总

1. Maker，对照质粒正常，酶切产物呈弥散状？
产生原因：1. 酶切时间过长，产生星号活性。

                 2. 酶浓度过高。

解决办法：1. 过夜的酶切改为6h，6h酶切改为3h，3h的酶切改为1h。

                 2. 降低酶量，1μl改为0.8或0.5μl。

2. Maker，对照质粒和酶切产物都呈弥散状？

产生原因：电泳的问题，包括，胶配制的问题；电泳缓冲液过于老旧；电压太高等。

解决办法：重新制胶，换电泳液，低电压跑，直到maker清晰明亮为止。

3. Maker正常，对照质粒和酶切产物呈弥散状？

产生原因：1. 质粒DNA质量差。

                 2. 质粒DNA降解。

解决办法：1. 重新提质粒。

                 2. 质粒提纯。

4. 切不开？
产生原因和解决办法:

1. 质粒有污染，污染物影响了酶的反应。重新提质粒或纯化质粒。

2. 质粒质量差。重新提质粒。

3. 酶切时间过短 。延长酶切时间。

4. 酶质量差或反复冻融多次导至失活。换酶后将酶分装使用。

5. Buffer反复冻融导至酶环境受到影响。换Buffer后将Buffer分装使用。

6. 双酶切Buffer选择不合适。选择合适的Buffer并判断是否用BSA。

7. 单酶切未去磷酸化导至自连。使用去磷酸化酶防止自连。

8. 酶切位点甲基化。换酶切位点或选择甲基化缺陷宿主菌。

9. 酶切位点突变。测序确认。

10. 双酶切温度有差异。先使用温度低的酶进行酶切后再酶切用温度较高的酶进行酶切。

11. 双酶切位点太过相近，切不开或切开后自连。换酶切位点，不选择挨着的酶切位点。


酶切流程

质粒提取之后，利用分光光度计测定260/280，260/230的比值。保证质粒的纯度。
选择常用，便宜（便宜了多做几次不心疼），双酶切位点距离合适的酶切位点。（实验室常用的，问师兄师姐）
确认好Buffer，是否添加BSA，确认酶切体系。（依据说明书或实验室的经验）
确认温度和酶切时间。如实验室有酶切位点的酶切经验，按照实验室经验进行。若无，按照说明书时间进行，如第一次且不开，选择加时间尝试。过夜连接可以放置37°C保温箱进行。
5. 一定要点Maker和原始质粒做对照！

6. 电泳时一定要确保你的电泳条件可以使Maker跑的清晰明亮，以便分析是否切开和找出未切开的问题。包括制胶，电压，电泳液等。

关于电泳的问题可以查看：PCR凝胶电泳问题，我全都总结出来了！