细胞复苏技巧

生物科研实验室

细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞系。细胞复苏是细胞培养的重要环节，下面小编具体给大家介绍下细胞复苏的protocal和注意事项！

01、细胞复苏的原理


细胞复苏是指将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。当恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反即刻恢复。细胞复苏过程升温要快，原则是慢冻快融，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。

02、细胞复苏的实验步骤


1. 从液氮罐中取出冻存管，置于-80℃冰箱数分钟，迅速放入37℃水浴锅中，不时摇动，使其在2min内急速融化，注意不要把冻存管的管口没入水浴中避免引起污染，复苏过程中一般细胞死亡率在25%左右；



2. 完全融化后，冻存管用75％酒精擦拭冷冻管外杀菌后，打开盖子，取出冻存管的细胞悬液，缓慢加入到有培养液的T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO培养。如果细胞需要去除冷冻保护剂，用移液枪将细胞悬液注入15mL无菌离心管中，再加5ml完全培养基，根据细胞类型选择合适的离心速度，低速离心5min，弃去上清，加入2-3mL预热的完全培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬；



3. 用培养液适当稀释后，将重悬的细胞接种到培养皿或者T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO培养，24h后，更换新鲜培养基，去除死细胞，三天可进一次换液，当细胞长到有80-90%汇合进行传代。


03、细胞复苏的注意事项


1. 取冻存细胞时应做好防护措施，戴好防冻手套，护目镜。如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。



2. 细胞放入水浴中复苏时注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅的水进入细胞冻存管造成细胞污染。



3. 打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。注意无菌操作，细胞复苏后的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。



4. 解冻时间在2min以内完成，且整个过程尽量避免吹打细胞产生气泡，导至细胞复苏后的生长状态不佳。



5. 复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染，实验室定期用过氧化氢熏蒸，细胞小黑点增多时用支原体检测试剂盒检测，并且及时清除。

04、如何避免冻存管爆炸


1.  选择质量好的进口内旋冻存管，拧紧盖子，防止液氮进入管内，液氮罐的细胞留种用，平时常用的细胞放在-80冰箱。



2. 冻存细胞时尽量加多一点冻存液，比如2ml冻存管加1.8ml冻存液，保留少量空间。



3. 取细胞时带好手套和防护眼镜，准备好镊子，避免手直接接触冻存管造成手冻伤或炸伤。



4. 从液氮里取出细胞时，先在液氮罐上面的蒸汽里放一会，然后再拿出来，将冻存盒残余的液氮流到罐内，避免拿出时冻伤，也避免细胞从液氮迅速升到室温发生爆炸。