琼脂糖凝胶电泳的常见问题&分析

生物科研实验室

（一）同样大小的DNA一起跑电泳，怎么条带不一样大？

DNA条带不一样大，本质上是DNA在凝胶中的迁移率不一样，有的跑得快，有的慢，通常情况同样大小的DNA，迁移率是一样的，条带位置也会一样。

但迁移率也受很多因素影响，例如DNA的构象。例如环状超螺旋结构的DNA，和同等大小的线性DNA（例如单位点酶切后的质粒），前者的迁移率要高，表现出来就是看上去超螺旋结构的DNA分子量好像小一点。

（二）为什么有时候加大电泳的电压，DNA会跑得快，但有时效果却不明显？

在较低电压时，提高电压，DNA的迁移率也会提高；但如果DNA分子量太大时，增加电压后对DNA迁移率的提高其实不成比例，说白一点，就是有效果，但不明显。

例如，当DNA分子量大于2Kb后，施加在电泳槽两端的电压不应该高于5V/cm，如果电泳槽长40cm，那么电压不应该高于200V。

（三）琼脂糖质量对电泳效果有多大影响？

有时候，换了一个批次的琼脂糖，或者更换了新的供应商的琼脂糖后，同样的样品进行电泳，效果也会有差异。

最常见的一个原因在于，琼脂糖本身的质量也是影响电泳结果的一个因素。

琼脂糖由大量的多糖组成，这些多糖会与硫酸盐吸附，成为一种叫硫酸化多糖的东西。在电泳时，它会产生正电荷，并向阴极移动，也就是和DNA移动的方向相反。

最终，DNA移动的阻力就增加了。这种现象叫做琼脂糖的电内渗（EEO）。因此，采购低水平电内渗的琼脂糖能有效提高分离效果。

（四）电泳缓冲液对电泳效果有多大影响？

电泳时，电泳缓冲液是一种经常需要更换的试剂。

最理想的状态，应该是，使用同一批次的电泳缓冲液母液进行1X电泳缓冲液的配置和对应档次电泳的凝胶配置。因为只有这样操作，才能保证整个离子缓冲环境是一致的。

有时我们会为了图方便，长期使用一个批次的1X电泳缓冲液进行实验，甚至到了母液都用完了，还在用之前那个批次的缓冲液进行实验。这样就会影响实验效果了。

另外，常见的电泳缓冲液的使用错误，还包括，直接倒入自来水替代电泳缓冲液，或者直接使用10X或50X的母液当缓冲液进行电泳。‘

前者因为缓冲体系内缺乏足够的离子，造成电导率很低，DNA迁移速度很慢，甚至完全不动了；而后者则因为电导率太高，造成整个缓冲液产热太厉害，甚至连凝胶都融化了。

（五）低熔点琼脂糖和普通琼脂糖有什么区别？有什么用途？

制作琼脂糖的原料通常是两种海藻：Gelidium和Gracilaria。普通的琼脂糖通常可以分离1～25Kb范围的DNA片段，熔化温度一般在85～90摄氏度，凝固温度一般在40～42摄氏度。

对普通琼脂糖进行羟乙基修饰后，可以降低琼脂糖的熔化温度。有的熔化温度甚至低至40～45摄氏度！

这么低的熔化温度有什么意义和应用呢？答案是低熔点琼脂糖主要应用于DNA的快速回收，想象一下，在比较低的温度时，例如50～60摄氏度，低熔点的凝胶已经熔化了，但这个温度下DNA还是很稳定，不会解链的。

因此，只需要进行简单的处理和升温就能实现DNA的回收，而且这种回收得到的DNA还能直接进行一些下游实验，例如细菌转化。

（六）电泳缓冲液就是TAE buffer嘛？还有其他嘛？有什么区别？

其实，琼脂糖电泳缓冲液有几种，分别是TAE、TBE和TPE，不过常用的一般是TAE。下面就来看看这三种缓冲液有什么区别。

相同点：大家都是为电泳提供一个离子缓冲环境。

不同点：组份不同，对应的缓冲能力不同，应用场景也略有不同。我们具体来看看。

TAE：Tris-乙酸盐+EDTA缓冲液组成；缓冲能力最弱，如果长时间的电泳，则不适合。其中一个标志是长时间电泳后，凝胶的阳极一侧会发生酸化，凝胶中的溴酚蓝会从蓝色变为黄色。因此，TAE需要定期更换，才能保证电泳效果。

TBE: Tris-硼酸盐+EDTA缓冲液组成；TPE：Tris-磷酸盐+EDTA缓冲液组成；缓冲能力比TAE要高，DNA在后两种缓冲液中的迁移速度较慢，适用于分离低分子量DNA的电泳实验。

（七）上样缓冲液是什么？有什么用？

在正式电泳开始之前，常使用上样缓冲液(loading buffer)来与样品DNA混合，这种缓冲液在电泳时有什么用呢？

Loading buffer在琼脂糖凝胶电泳中的作用主要有三个：

01 它可以增加样品的密度，确保DNA样品可以均匀沉入上样孔内；

02 Loading buffer含有颜色指示剂，除了帮助上样时观察样品是否准确加入孔内

03 这种颜色指示剂主要由溴酚蓝和二甲苯蓝FF组成，它们两者在电泳中会按照固定的迁移速度移动，所以，我们还可以在电泳时通过Loading buffer帮助我们观察条带的迁移进度

（八）电泳条带看起来像个微笑的表情是什么原因？

最常见的原因是因为上样量太大了，常见的凝胶孔位的宽度是5mm，如果往里面加载的样品超过0.5ug的话，就表明过量了。
最后，电泳时就会出现条带两侧卷起弯曲（像微笑表情）、模糊不清、条带拖尾的现象。DNA片段越大，这种现象会越明显。

需要补充的一点是，并不是所有出现条带拖尾的现象，都代表样品量过载，也有可能是含有其他杂质或样品降解造成的。

（九）点样孔内出现很亮的条带，且不动，是什么原因？

DNA分子在电压的推动下，会向前移动，但如果其分子量非常大，体积也就会变得很大，以至于无法穿过琼脂糖向前移动。

如果在基因组DNA提取后，样本中含有蛋白质，那么就很可能出现这种现象。其原因在于基因组中有大量的组蛋白和DNA缠绕在一起，如果提取过程中去除不干净，这些蛋白就会和DNA一起进入后续电泳中。

而蛋白在琼脂糖电泳中，无疑是体积超标了，因此整个孔内的DNA也无法移动出去。