实验干货丨微生物学检测——菌落总数

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菌落总数又称需氧菌总数、嗜氧菌总数，在英文标准中的术语有Total plate count, Standard plate-count bacteria, Aerobic bacterial count，Colonies number等，是微生物学检测技术中应用最广泛的一种卫生学检测技术，亦是嗜温细菌和真菌的菌落总计数，其通过一定条件下如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等，每单位（如克、毫升等）检样所生长出来的微生物，在卫生学上可以表示被污染程度的标志。

常见操作方法

菌落计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN法），其中平皿法可分为倾注平皿法和涂布平皿法，常见的菌落总数操作方法见表1。

测试标准	适用范围	操作方法
GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》	食品	倾注平皿法/菌落总数测试片
FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》	食品	倾注平皿法/螺旋板法
GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》	饲料	倾注平皿法
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》	游泳池水	倾注平皿法
GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法  微生物指标》	饮用水/水源水	倾注平皿法/酶底物法
WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》	环境	六级筛孔撞击式微生物采样器
GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准  附录B2》	一次性卫生用品	倾注平皿法
《化妆品安全技术规范》2015版	化妆品	倾注平皿法
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》	化妆品	平皿法/膜过滤法
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》	药品	平皿法/薄膜过滤法/MPN法
BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》
EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》

表1 常见菌落总数的操作方法汇总

根据上表的适用范围和操作方法可得出，平皿法是使用范围最广。

根据测试标准适用范围和样品特性：

A.平皿法因可操作性性强，会更多用于污染度高的被检样品；

B.薄膜过滤法适用于测试量需求大且污染度一般的液体样品；

C.MPN法可用于微生物计数时精确度较差时，包括对于某些微生物污染度很小的样品。

故在日常测试中，可根据样品的污染度情况去选择更合适的菌落总数测试操作方法。

样品的取样量与稀释液选择

样品的取样量与其质量标准或测试方法去选择，对于官方标准未明确取样量的，亦可根据结果的代表性加大取样量。稀释缓冲液的选择则是要求样品在稀释缓冲液中能够充分混合，从而保证样品的均一性，故不同样品，会有不同的稀释液需求。日常工作中，常见的稀释缓冲液与要求见表2。

测试标准	样品量	稀释液	备注
GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》	25g/mL	无菌生理盐水/磷酸盐缓冲液
FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》	50g/mL	磷酸盐缓冲液/无菌水
GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》	25g/10g	0.85%生理盐水/磷酸盐缓冲液
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》	原液	无菌生理盐水
GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法  微生物指标》	原液	无菌生理盐水
WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》	28.3L/min，（5-15）min	不适用
GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准  附录B2》	10±1g	无菌生理盐水（200mL）	不进行梯度稀释，做5平行
《化妆品安全技术规范》2015版	10g/mL	无菌生理盐水	无法充分溶解稀释液中的样品可加吐温80和/或石蜡
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》	1:10（样品：加稀释液后）	无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等	最终的取样量与稀释液，需通过样品方法学适用性验证方能使用。
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTS》
BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》
EP  9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》

表2 常见的稀释缓冲液信息汇总

常见培养条件

菌落总数的培养条件会因不同的样品类型或制定机构而有所差异，其差异包括培养基、培养温度和培养时间的选择。菌落总数常见的培养条件见表3。

测试标准	培养基	培养温度	培养时间
GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》	平板计数琼脂（PCA）	36±1℃（水产品30±1℃）	48±2h（水产品72±3h）
FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》		35±1℃（牛奶32±1℃）	48±2h
GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》	营养琼脂（NA）	30±1℃	72±3h
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》		36±1℃	48h
GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法  微生物指标》		36±1℃	48±2h
WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》		35~37℃	48h
GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准  附录B2》		35±2℃	48h后
《化妆品安全技术规范》2015版	卵磷脂、吐温80-营养琼脂 （LTNA）	36±1℃	48±2h
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》	胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）	32.5±2.5oC	72±6h
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》			3~5天
BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》
EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》

表3 菌落总数的常见培养条件汇总

结果观察与报告

菌落总数在进行计数时，肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU/cfu，Colony Forming Units）进行报告。在计数时，首先需明确计数范围是否符合要求，从而保证测试结果的准确性和可靠性，不同的测试方法在首选计数范围会有一定差异，以及显色剂在观察中的应用也有一定的要求。详情见表4。

测试标准	培养基中是否可加显色剂	首选计数范围	最终结果报告
GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》	是	30~300cfu	100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字，＞300cfu的则报告TNTC2，采用“四舍五入”。
FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》	否	25~250cfu	＜25cfu则报告＜25或实际值，＞250cfu则报告＞250或TNTC2。
GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》	否	30~300cfu	100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字，＞300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》	否	30~300cfu	100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字，＞300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。
GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法  微生物指标》	否	30~300cfu	100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字，＞300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。
WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》	否	无	报告cfu/m3
GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准  附录B2》	否	无	全部无生长报＜4cfu/g（mL），若生长，报100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字。
《化妆品安全技术规范》2015版	是	30~300cfu	100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字，＞300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》	否	平皿法：30~300cfu；薄膜过滤法：15~150cfu。	100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字。
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》	否	平皿法：不超过250cfu；薄膜过滤法：记录结果。	取两位有效数字报告
BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》
EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》	否	平皿法：不超过300cfu；薄膜过滤法：不超过100cfu	取两位有效数字报告
注： 1. 显色剂一般为TTC，TTC全称为0.5%氯化三苯四氮唑。加此显示剂后，多数菌落显示红色。 2. TNTC全称为多不可数，即Too Number To Count。

表4  结果观察与报告的一般要求

菌落总数的测定，不同样品有不同的特性，故在进行此方面卫生学测试时，结合行业需求，以及样品的生产工艺、消费对象、使用方式等需求，选择合适的测试操作流程，同时保证在报告结果时，亦需根据市场所选用的方法进行报告结果。

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综合以上，卫生学的菌落测试在实验操作中虽然有差异，但总体的差异性不大，比如培养基都是非选择性生长培养基，培养温度基本在35℃左右，培养时间则温度越高，时间则可减少。故保证菌落总数测试结果的准确性与可靠性时，根据实际需求，通过调节测试方法的取样、稀释液、培养条件等来建立更符合本实验室的菌落总数测试方法。